蘇蓓蓓 甘泉 甘才斌

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚科，河南 453000

銀屑病是由免疫、遺傳及環(huán)境等多種因素介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，具體發(fā)病機(jī)制不清［1］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）是JAK/Stat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最為關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子之一，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和血管生成、免疫調(diào)節(jié)及癌癥等方面具有重要的生物學(xué)作用［2］。既往研究認(rèn)為，JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及凋亡、機(jī)體炎癥因子的表達(dá)等在銀屑病發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵性作用［3-4］。二甲雙胍是一種臨床上廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病的降糖藥，對(duì)皮膚科諸多疾病如銀屑病、痤瘡等也具有一定作用［5］。研究顯示［6-7］，二甲雙胍可通過下調(diào)JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制食管鱗狀上皮和胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。二甲雙胍對(duì)于銀屑病的潛在療效是否可能通過減少Stat3磷酸化實(shí)現(xiàn)尚不清楚。我們通過構(gòu)建咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損模型，觀察二甲雙胍對(duì)小鼠銀屑病樣皮損的嚴(yán)重程度、血清炎癥因子及皮損組織中白細(xì)胞介素17（IL-17）和p-Stat3表達(dá)水平的影響。

材料與方法

一、材料

6 ～8周齡雄性健康SPF級(jí)Balb/c小鼠，體重17～24 g，產(chǎn)自河南新鄉(xiāng)華蘭生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：201801140035，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0001］，小鼠在室溫 23 ℃ ±1 ℃、明/暗各12 h的條件下飼養(yǎng)，自由取食（高壓蒸汽滅菌用水及正常飼料喂養(yǎng)），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SCXK（豫）2017-002。二甲雙胍粉劑（美國Sigma公司）純度≥97%，用pH6.8 的磷酸鹽緩沖液在超聲振蕩下溶解。咪喹莫特乳膏（規(guī)格：3 g∶0.15 g，湖北科益藥業(yè)股份有限公司）。一抗為兔抗鼠IL-17及p-Stat3 單克隆抗體（英國Abcam 公司），二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG單克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。小鼠IL-17 和腫瘤壞死因子α（TNF-α）Quantikine ELISA 試劑盒（美國R&D 公司），鼠IL-6 Quantikine ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

二、方法

1.動(dòng)物分組和藥物干預(yù)處理：將50只Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、咪喹莫特組、3 個(gè)咪喹莫特聯(lián)合二甲雙胍組（IM-Met組中二甲雙胍濃度分別為 100、150 和 200 g/L），每組 10 只。5 組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.98，P＞ 0.05）。小鼠背部使用脫毛膏脫毛，對(duì)照組局部外用凡士林乳膏且腹腔注射生理氯化鈉溶液0.3 ml，咪喹莫特組局部外用咪喹莫特［8］且腹腔注射生理氯化鈉溶液0.3 ml，3 個(gè)IM-Met 組局部外用咪喹莫特，腹腔分別注射100、150 和 200 g/L 二甲雙胍溶液 0.3 ml。于每天9：00 涂藥和腹腔注射，以首次干預(yù)作為第1 天，連續(xù)7 d，每日記錄小鼠銀屑病樣皮損的面積與嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）積分，7 d 后處死所有小鼠。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用二甲雙胍干預(yù)IM-Met 組7 d后，對(duì)照組、咪喹莫特組和100、150、200 g/L IM-Met組小鼠隨機(jī)血糖值分別為10.45、9.63、11.87、9.32、10.73 mmol/L，5 組間隨機(jī)血糖值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.28，P＞0.05）；晚8點(diǎn)小鼠禁食后于清晨7 點(diǎn)測(cè)5 組小鼠空腹血糖值分別為5.87、4.63、6.14、5.55、6.02 mmol/L，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.57，P＞0.05）。

2.Western 印跡檢測(cè)皮損 IL-17 和 p-Stat3 的表達(dá)：取5 組小鼠背部皮膚置于研缽中，加入液氮并研磨成粉末后移入1.5 ml EP 管，加入500 μl RIPA裂解液（含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑），冰上孵育約30 min，4 ℃下12 000 r/min（離心半徑4 cm）離心20 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱中保存。取5 μl 蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)液中電轉(zhuǎn)，牛奶封閉，加入一抗IL-17 抗體（1∶1 000）、p-Stat3 抗體（1∶1 000）、β 肌動(dòng)蛋白抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶的灰度值，以目的蛋白與β 肌動(dòng)蛋白灰度值比值表示蛋白表達(dá)水平。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.血清IL-17、IL-6和TNF-α水平測(cè)定：處死小鼠時(shí)取眶周血5 ml于抗凝管中，在常溫下離心收集上層血清-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，具體步驟參考試劑盒說明書。每只小鼠測(cè)定時(shí)均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，取3次檢測(cè)的平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、二甲雙胍對(duì)小鼠銀屑病樣皮損形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的影響

7 d后，對(duì)照組小鼠背部皮膚未出現(xiàn)明顯變化，而咪喹莫特組小鼠背部出現(xiàn)大面積紅斑和鱗屑。100、150 和 200 g/L IM-Met 組小鼠背部紅斑面積和鱗屑相對(duì)于咪喹莫特組顯著減輕，見圖1。150 g/L IM-Met 組紅斑和鱗屑嚴(yán)重程度顯著低于100 g/L IM-Met組，但同200 g/L IM-Met組比較無明顯區(qū)別。

圖1 第7天肉眼觀察5組小鼠背部皮膚狀況 對(duì)照組小鼠背部皮膚光滑；咪喹莫特（IM）組小鼠背部出現(xiàn)紅斑和大量厚層鱗屑；3個(gè)IM-二甲雙胍（IM-Met）組小鼠背部均出現(xiàn)紅斑和厚層鱗屑，但程度輕于IM組小鼠；150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met組紅斑面積和鱗屑厚度相近，但均少于100 g/L IM-Met組

圖2 5組小鼠背部皮損的組織學(xué)改變（HE×100） 對(duì)照組小鼠背部皮膚表皮及真皮層結(jié)構(gòu)無異常；咪喹莫特（IM）組表皮增厚，表皮突延長(zhǎng)，伴有角化不全及微膿腫；3個(gè)IM-二甲雙胍（Met）組表皮稍增厚，伴有角化不全及微膿腫

組織病理檢查（HE染色）結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組比較，咪喹莫特組表皮明顯增厚，表皮突延伸伴有角化不全及微膿腫；而IM-Met 組表皮增厚程度輕于咪喹莫特組；150 g/L IM-Met 組表皮增厚程度輕于100 g/L IM-Met組，但同200 g/L IM-Met組相比變化不明顯。

二、二甲雙胍對(duì)小鼠PASI積分的影響

5 組小鼠 PASI 積分第 1 ～ 7 天變化見圖 3。第1 ～3天咪喹莫特組及IM-Met組4組小鼠間PASI積分無顯著差異。第4 ～7 天，咪喹莫特組PASI 積分顯著高于IM-Met 組小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 9.45、12.82、19.66 和 22.47，均P＜0.05）。第 4 天開始 100 g/L IM-Met 組 PASI 積分顯著高于150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而150 g/L IM-Met組和200 g/L IM-Met 組第1 ～7 天差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為 1.34、0.98、1.10、1.18、0.35、0.33 和0.29，均P＞0.05）。

三、二甲雙胍對(duì)小鼠銀屑病樣皮損中IL-17和p-Stat3蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 5組小鼠皮損銀屑病皮損面積與嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）積分變化 IM，咪喹莫特；Met，二甲雙胍

見圖4 和表1。Western 印跡檢測(cè)顯示，5 組小鼠背部皮損IL-17和p-Stat3蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。咪喹莫特組IL-17和p-Stat3蛋白表達(dá)水平同對(duì)照組相比顯著升高（均P＜0.01）；150 g/L200 g/L IM-Met 組 IL-17 和 p-Stat3 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但均低于100 g/L IM-Met 組（均P＜0.05）和咪喹莫特組小鼠（均P＜0.05）；100 g/L IM-Met組小鼠背部皮損區(qū)IL-17和p-Stat3蛋白表達(dá)同咪喹莫特組相比顯著降低（均P＜0.05）。

四、二甲雙胍對(duì)小鼠血清IL-17、IL-6 和TNF-α表達(dá)水平的影響

5組小鼠血清炎癥因子IL-17、IL-6和TNF-α水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為15.69、36.78和20.41，均P＜0.05），對(duì)照組3 種炎癥因子水平均顯著低于其余4 組，而咪喹莫特組均顯著高于其余4 組（均P＜0.05）。3 個(gè)IM-Met 組血清炎癥因子表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），200、150 和 100 g/L IM-Met 組 IL-17、IL-6 和TNF-α水平依次升高。見表2。

討 論

多項(xiàng)研究表明，JAK/Stat3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在銀屑病發(fā)病機(jī)制中具有重要作用［3-4，9-10］。Sano 等［9］發(fā)現(xiàn)，K5.Stat3c轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中過度表達(dá)活化的Stat3，出生2周后小鼠皮膚開始出現(xiàn)斑塊和鱗屑，組織病理和銀屑病病理特點(diǎn)相一致，使用寡聚核苷酸抑制Stat3 蛋白表達(dá)可顯著減少K5.Stat3c 小鼠銀屑病樣皮損形成。冉立偉等［10］通過免疫組化檢測(cè)21例銀屑病患者皮損和20例正常皮膚Stat3 和p-Stat3 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損Stat3 和 p-Stat3 表達(dá)水平顯著升高，且與 PASI 呈正相關(guān)。

圖4 5 組小鼠背部皮膚組織中白細(xì)胞介素17 和p-Stat3 蛋白的表達(dá)情況 1：對(duì)照組；2：咪喹莫特（IM）組；3：100 g/L IM-二甲雙胍（Met）組；4：150 g/L IM-Met組；5：200 g/L IM-Met組

表1 銀屑病樣小鼠背部皮膚組織中白細(xì)胞介素17（IL-17）和p-Stat3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

表2 銀屑病樣小鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，）

表2 銀屑病樣小鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，）

注：n=10。IL：白細(xì)胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IM：咪喹莫特；Met：二甲雙胍。a 與對(duì)照組比較，P＜0.05；b 與咪喹莫特組比較，P＜0.05；c 與200 g/L IMMet組比較，P＜0.05；d 與150 g/L IM-Met組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組咪喹莫特組IM-100 g/L Met組IM-150 g/L Met組IM-200 g/L Met組F值P值IL-17 15.882±1.793 49.567±5.697a 44.008±1.722a b c d 33.388±1.556a b c 26.720±2.156a b 15.69＜0.05 IL-6 96.294±3.195 281.014±12.881a 260.926±7.724a b c d 210.741±4.440a b c 174.997±9.501a b 36.78＜0.05 TNF-α 128.779±3.266 291.117±3.245a 271.409±3.037a b c d 249.434±8.594a b c 193.034±6.661a b 20.41＜0.05

二甲雙胍作為一種常用的降糖藥在臨床上使用多年，但其對(duì)皮膚科疾病如銀屑病也具有潛在的治療效果。2008 年一項(xiàng)包含36 702 例初診為銀屑病患者的病例對(duì)照研究結(jié)果顯示，口服二甲雙胍能顯著降低銀屑病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［11］。Wu 等［12］調(diào)查9 243 例糖尿病患者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)?？诜纂p胍可顯著降低銀屑病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Singh 和 Bhansali［13］對(duì)38例銀屑病合并代謝綜合征患者開展的一項(xiàng)單中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者口服二甲雙胍聯(lián)合甲氨蝶呤后紅斑、鱗屑及持續(xù)時(shí)間得分顯著低于單獨(dú)口服甲氨蝶呤患者。既往研究提示，二甲雙胍治療銀屑病的可能機(jī)制包括：上調(diào)人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)腺苷酸活化蛋白激酶和p-ERK1/2 水平，通過抑制P38 絲裂原激活的蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制mTOR 及其下游因子核糖體S6 蛋白激酶的蛋白表達(dá)來抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖［14-15］；抑制 Raf/EPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而降低人角質(zhì)形成細(xì)胞Nrf2的表達(dá)［16］，而Nrf2屬于調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的關(guān)鍵蛋白之一［17］。

本研究結(jié)果顯示，3個(gè)IM-Met組小鼠背部皮膚紅斑面積、鱗屑嚴(yán)重程度和PASI 積分、皮損中IL-17及p-Stat3蛋白表達(dá)水平和血清炎癥因子水平均顯著低于咪喹莫特組；200、150 g/L 二甲雙胍溶液對(duì)于小鼠皮膚紅斑面積和鱗屑嚴(yán)重程度的降低及PASI 積分的改變無顯著差異，且這兩組小鼠背部皮損區(qū)p-Stat3和IL-17蛋白水平也同樣無顯著差異，但均低于咪喹莫特組和100 g/L IM-Met組小鼠，提示二甲雙胍對(duì)于銀屑病的治療作用可能是通過減少Stat3的活化，同時(shí)治療作用呈非劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與二甲雙胍可減少Stat3活化的結(jié)論［6-7］相一致，但上述研究均未明確表明二甲雙胍如何抑制JAK/Stat3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及具體的分子生物學(xué)相關(guān)機(jī)制。盧博等［18］采用不同濃度二甲雙胍作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 和U266 發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過抑制Stat3 的磷酸化抑制RPMI8226和U266細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。我們對(duì)銀屑病小鼠模型血清炎癥因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍濃度越高，小鼠血清炎癥因子水平越低，可能因?yàn)槎纂p胍干預(yù)后，血清炎癥因子的變化相對(duì)于皮損區(qū)蛋白水平的變化更加敏感，也可能與二甲雙胍本身可通過抑制蛋白激酶B 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路進(jìn)而抑制NF-κB活化、降低機(jī)體炎癥因子釋放有關(guān)［19-20］，但這些推測(cè)需要更多的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

以上結(jié)果表明，二甲雙胍顯著降低銀屑病小鼠模型機(jī)體的炎癥狀態(tài)可能是通過減少Stat3磷酸化所致。然而，本研究的局限性在于僅僅證明二甲雙胍能夠減少Stat3 的磷酸化，并未對(duì)調(diào)節(jié)Stat3 的上游信號(hào)如JAK或腺苷酸活化蛋白激酶等進(jìn)行研究。盡管多項(xiàng)研究顯示，二甲雙胍能顯著抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖［21-22］，但這些研究的局限性在于僅僅探討了二甲雙胍對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，而非銀屑病患者或動(dòng)物模型。我們首次探討二甲雙胍對(duì)銀屑病樣小鼠模型的作用及其相關(guān)機(jī)制，為該藥應(yīng)用于銀屑病的治療提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心所有參與本實(shí)驗(yàn)的老師、本科生及研究生