張宇 韓悅 徐蓓蕾 凌詩琪 羅陽 劉笑純 姚煦

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院過敏與風(fēng)濕免疫科，南京 210042

目前認(rèn)為特應(yīng)性皮炎（AD）發(fā)病是在一定遺傳背景下皮膚屏障功能異常和機體免疫應(yīng)答異常的結(jié)果［1］。臨床上AD的各種治療方案難以達(dá)到長期緩解和預(yù)防復(fù)發(fā)的效果，嚴(yán)重影響患者的身心健康并增加家庭就醫(yī)負(fù)擔(dān)。快速、有效地建立AD 小鼠模型對深入闡明AD的發(fā)病機制和開發(fā)新藥等具有重要意義。目前研究用的AD小鼠模型主要有自發(fā)突變的小鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型和藥物/過敏原誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠模型。其中，外涂藥物/過敏原誘導(dǎo)的AD小鼠模型較為常用，但該模型造模周期長，且操作復(fù)雜，不利于在短期內(nèi)建立［2］。近期有學(xué)者應(yīng)用卡泊三醇外涂誘導(dǎo)AD，其最突出優(yōu)點是可快速便捷地誘發(fā)AD樣皮炎表現(xiàn)［3］，但引起AD系統(tǒng)病理表現(xiàn)并不顯著，并且缺乏過敏原特異性IgE。我們嘗試用卵清蛋白（OVA）經(jīng)皮致敏聯(lián)合卡泊三醇外涂造模以縮短造模周期，并誘導(dǎo)建立系統(tǒng)致敏的理想AD模型。

材料與方法

一、材料

OVA（美國Sigma 公司）用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）配成20 g/L，保存于-20 ℃?？ú慈疾雱榈溊麏W制藥有限公司產(chǎn)品，批號A52859A。IgE檢測試劑盒（美國BD 公司），OVA 特異性IgE 檢測試劑盒（美國BioLegend 公司，貨號439807）。兔抗鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、白細(xì)胞介素13（IL-13）、干擾素γ單克隆抗體均來自英國Abcam公司。

二、方法

1.小鼠分組及致敏方案：15只SPF級健康純系雌性C57BL/6 小鼠［動物質(zhì)量合格證編號SYXK（蘇）2016-0011，動物使用許可證號SCXK（滬）2016-0004］，8 周齡，體重20 g 左右，來自北京維通利華公司，在南京醫(yī)科大學(xué)模式動物所飼養(yǎng)并進(jìn)行實驗，隨機分為3 組：①卡泊三醇 +OVA 組（6 只），每天先在兩側(cè)耳部涂抹1 nmol/L卡泊三醇14.3 μl，風(fēng)干后涂抹 20 g/L OVA 25 μl 每日 1 次；②卡泊三醇組（6 只），兩側(cè)耳部涂抹1 nmol/L 卡泊三醇14.3 μl；③對照組（3 只），兩側(cè)耳部涂抹75%乙醇14.3 μl，均連續(xù)涂抹12 d。分別在造模前和第14天時拍攝小鼠耳部照片并測量記錄小鼠耳厚度，取小鼠尾靜脈血，檢測血清總IgE 和OVA 特異性IgE 水平，在第14天取小鼠耳廓皮膚制做切片并行HE和免疫組化染色。

2.耳厚度測定和組織病理學(xué)檢查：用耳厚度測量儀在涂抹前和第14 天測量小鼠耳廓厚度。于第14 天測量完畢后脫頸處死小鼠，剪下小鼠耳朵，浸泡于4%甲醛12 h 后，石蠟包埋，切片，1 張用于HE 染色，每張切片取10 個獨立高倍視野（HPF，× 100），計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞，取均值（Eo/HPF）；1張切片做甲苯胺藍(lán)染色，觀察肥大細(xì)胞，照相記錄。

3.免疫組化染色檢測炎癥因子表達(dá)水平：取小鼠耳部皮膚組織石蠟切片，按步驟加入兔抗鼠TSLP（1∶20稀釋）、IL-13（1∶10稀釋）、干擾素γ（1∶5稀釋）抗體室溫孵育2 h，山羊血清封閉，加驢抗兔二抗及顯色劑染色，脫水，晾干，封片，照相記錄，陽性結(jié)果為表皮和真皮內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆?；蜃睾稚旧?yīng)用IPP 軟件計算平均吸光度（IOD），分析細(xì)胞因子表達(dá)量。

4.ELISA 檢測小鼠血清總IgE 和OVA 特異性IgE水平：用兔抗小鼠IgE抗體2 mg/L 包被酶標(biāo)板，每孔100 μl，4 ℃過夜，按照試劑盒說明書操作染色并終止反應(yīng)，檢測血清總IgE水平。將1 mg/L OVA包被于ELISA 板過夜，參照BioLegend Mouse OVA specific IgE試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清OVA特異性IgE水平。

5.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 20.0 和Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計、繪圖。數(shù)據(jù)用表示。造模前后耳厚度、總IgE濃度比較采用配對t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA 檢驗），組間兩兩比較采用Tukey-kramer 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠皮膚表現(xiàn)

1.耳部皮損：第14天時，卡泊三醇+OVA組和卡泊三醇組小鼠耳部皮膚均干燥、脫屑，有明顯毛細(xì)血管擴張，且卡泊三醇+OVA組較卡泊三醇組脫屑更明顯。對照組小鼠皮膚無明顯異常。見圖1。

2.模型小鼠耳厚度比較：造模前，3 組間耳厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.075）。造模后，卡泊三醇+OVA 組和卡泊三醇組小鼠耳厚度均顯著高于造模前（t值分別為20.503、9.968，均P＜ 0.001），亦顯著高于對照組（q值分別為 4.608、4.924，P≤0.001），而卡泊三醇+OVA組與卡泊三醇組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.674，P=0.231）。見表1。

二、小鼠皮膚組織病理表現(xiàn)

1.HE染色：與對照組相比，卡泊三醇+OVA組和卡泊三醇組皮損表皮厚度增加，炎癥反應(yīng)增強，真皮炎癥細(xì)胞浸潤，呈亞急性皮炎樣改變（圖2）。

2.甲苯胺藍(lán)染色：卡泊三醇+ OVA 組與卡泊三醇組、對照組比較，肥大細(xì)胞增多，見圖2。單因素方差分析顯示，3組間每高倍視野（×400）下嗜酸性粒細(xì)胞均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 21.96，P=0.001）。與對照組（0.3 ± 0.58）嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)相比，卡泊三醇 + OVA 組顯著增多（4.5 ± 1.29，q=6.092，P= 0.001），而卡泊三醇組沒有顯著變化（1.25± 0.5，q=1.340，P=0.342）；卡泊三醇 +OVA組顯著高于卡泊三醇組（q=5.134，P=0.001）。

3.免疫組化染色：見表1、圖3。免疫組化示，TSLP 在小鼠表皮基底層、棘層和真皮小血管上皮細(xì)胞表達(dá)，IL-13、干擾素γ主要在真皮內(nèi)表達(dá)。3組間TSLP、干擾素γ 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但I(xiàn)L-13 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.159，P=0.032）。其中，卡泊三醇 +OVA 組IL-13 表達(dá)顯著高于對照組（q=3.170，P=0.021），但卡泊三醇組與對照組間（q=1.139，P=0.447）及卡泊三醇+OVA組與卡泊三醇組間（q=2.031，P=0.073）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 卡泊三醇單獨或聯(lián)合卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠皮損表現(xiàn) 外涂藥物致敏12 d后，第14 天觀察結(jié)果，卡泊三醇+OVA 組和卡泊三醇組小鼠耳部皮膚均干燥、脫屑，卡泊三醇+OVA組更明顯，對照組小鼠耳部皮膚無明顯異常

表1 卡泊三醇單獨或聯(lián)合卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠耳厚度及造模后皮膚中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、白細(xì)胞介素13（IL-13）和干擾素γ表達(dá)水平比較（）

表1 卡泊三醇單獨或聯(lián)合卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠耳厚度及造模后皮膚中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、白細(xì)胞介素13（IL-13）和干擾素γ表達(dá)水平比較（）

注：a 與對照組比，P ＜ 0.01

組別TSLP 干擾素γ對照組卡泊三醇組卡泊三醇+OVA組F值P值n 3 6 6耳厚度（mm）造模前0.144±0.001 0.149±0.005 0.144±0.003 3.186 0.075造模后0.208±0.003 0.370±0.050a 0.355±0.030a 12.892 0.001 57.56±10.33 72.82±5.40 75.94±5.86 3.413 0.102 IL-13 55.49±9.92 63.26±12.30 77.12±5.46a 5.159 0.021 62.03±5.98 70.91±9.89 81.10±8.01 1.015 0.417

圖2 卡泊三醇單獨或聯(lián)合卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠皮損HE 染色（×40）及甲苯胺藍(lán)染色（×100）結(jié)果 表皮增厚、肥大細(xì)胞浸潤程度由重到輕依次為卡泊三醇+卵清蛋白組、卡泊三醇組和對照組

三、小鼠血清IgE水平

1.血清總 IgE 濃度：卡泊三醇+OVA組第14天時總IgE濃度（8 278.56 ± 3 297.68）μg/L，較致敏前（892.64 ± 82.83）μg/L 明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.132，P= 0.026）?？ú慈冀M造模前后總IgE 濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（947.25 ± 206.83）比（4 330.95 ± 1 223.26）μg/L，t=3.262，P= 0.052）。造模后，卡泊三醇 + OVA 組與卡泊三醇組（4 330.95± 1 223.26）μg/L 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.561，P=0.194）。對照組在造模前（175.333 ± 11.941）μg/L 與造模后（215.638 ± 23.186）μg/L 血清總IgE 水平均較低（t= 3.162，P=0.471）。

2.OVA 特異性 IgE 濃度：造模后卡泊三醇+ OVA 組OVA 特異 性 IgE 水 平 為（192.846 ±15.391）μg/L，顯著高于卡泊三醇組［（8.492 ±3.879）μg/L，q= 22.476，P＜ 0.001］和對照組［（9.384 ± 6.579）μg/L，q=22.476，P＜ 0.001］。

圖3 免疫組化檢查卡泊三醇單獨或聯(lián)合卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠皮膚胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、白細(xì)胞介素13和干擾素γ的表達(dá)（×200） 各組間TSLP、干擾素γ表達(dá)無明顯差異，但卡泊三醇+卵清蛋白組IL-13表達(dá)顯著高于對照組

討 論

目前認(rèn)為AD發(fā)病是在一定遺傳背景下皮膚屏障功能異常、環(huán)境過敏原刺激和機體異常免疫應(yīng)答的結(jié)果，目前確切的作用機制尚不明確。大量的研究證據(jù)顯示，在皮膚屏障功能異常的基礎(chǔ)上，過敏原經(jīng)皮致敏和皮膚表面微生物菌群的組成異常引發(fā)了AD 患者的異常免疫應(yīng)答［4］。研究發(fā)現(xiàn)，60%～70%的AD 患者OVA 和塵螨等常見特應(yīng)性抗原斑貼試驗陽性，斑貼部位接觸變應(yīng)原后，皮膚內(nèi)炎性樹突狀表皮細(xì)胞（inflammatory dendritic epidermal cells）數(shù)量增加［5-6］。在小鼠實驗中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，經(jīng)不完整表皮涂布花生或牛奶抗原會引發(fā)以Th2 為主的過敏反應(yīng)［7］。本研究中我們在通過局部外用卡泊三醇引起表皮角質(zhì)形成細(xì)胞局部炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致皮膚屏障功能異常前提下，聯(lián)合致敏模型常見的模式過敏原OVA 外涂小鼠耳部皮膚誘導(dǎo)AD小鼠模型。與單獨使用OVA造模比較，本文方案明顯縮短了造模所需時間，且實驗操作簡便可實施性強，提高了OVA 經(jīng)皮致敏的效率。因本研究旨在闡明卡泊三醇與OVA+卡泊三醇兩組方案在致特應(yīng)性皮炎模型中的差異，故未單獨使用OVA造模作為對照是本文的不足。

本實驗應(yīng)用的卡泊三醇是維生素D3 類似物，在臨床上常用于銀屑病的治療，可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化，并可選擇性抑制IL-1 對T細(xì)胞的刺激功能，有免疫抑制作用，外用卡泊三醇的不良反應(yīng)主要為皮膚刺激，表現(xiàn)為用藥部位燒灼、紅斑、脫屑。2006年，Li等［8］首次應(yīng)用卡泊三醇外涂小鼠耳部引起小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞TSLP表達(dá)升高，從而導(dǎo)致AD 樣癥狀。小鼠局部皮膚涂抹卡泊三醇可引起表皮增生，真皮炎癥細(xì)胞浸潤，包括嗜酸性粒細(xì)胞和CD3+、CD4+、CD11C+、GR-1+細(xì)胞及肥大細(xì)胞等，同時皮膚炎癥因子以Th1 和Th2 型為主，包括TSLP、IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-10、IL-8、干擾素γ 和腫瘤壞死因子β 等［3］，而且局部外涂卡泊三醇也可引起血清總IgE 升高，但升高并不顯著。此模型已經(jīng)應(yīng)用于許多AD 的實驗室研究中。但此模型在引起表皮屏障功能異常中的作用還沒有被闡明。

因OVA 單獨構(gòu)建經(jīng)皮致敏模型時，需要破壞小鼠皮膚屏障，傳統(tǒng)做法為剃除小鼠背部毛發(fā)，用膠帶反復(fù)粘貼造成表皮缺失，再外涂OVA 抗原誘發(fā)AD 樣皮炎，該方法費時費力，對操作要求較高，且可能引發(fā)真皮缺失或繼發(fā)感染影響實驗結(jié)果。本文中我們通過局部外用卡泊三醇引起表皮角質(zhì)形成細(xì)胞局部炎癥反應(yīng)［3］，導(dǎo)致皮膚屏障功能異常，同時聯(lián)合過敏原OVA 外涂小鼠耳部皮膚誘導(dǎo)AD小鼠模型。與單獨使用OVA造模比較，本文方案明顯降低了造模所需時間，實驗操作簡便，可實施性強，而且提高了OVA 經(jīng)皮致敏的效率?？ú慈悸?lián)合OVA的臨床表現(xiàn)為AD樣皮炎，與單獨使用卡泊三醇造模比較，表皮增生和炎癥細(xì)胞浸潤更加明顯，血清總IgE 和OVA 特異性IgE 不同程度升高。

總之，我們成功建立過敏原引起的外源性AD小鼠模型，為今后AD的研究，尤其為過敏原引起的外源性AD的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突