任嬌艷,廖林鋒,李宇娟,林曉玲,謝麗平,梁 明,尹西拳,袁爾東,*

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510641; 2.中新國際聯(lián)合研究院,廣東廣州 510000; 3.無限極(中國)有限公司,廣東廣州510665;)

近年來,大分子與小分子的相互作用已經引起研究者們極大興趣[1-4]。研究發(fā)現,小分子化合物與大分子的相互作用可影響化合物的結構、功能及營養(yǎng)特性。Anaid等[5]研究發(fā)現油菜蛋白水解物與酚類化合物相互作用后,蛋白水解物在細胞內抗氧化能力得到明顯提高。Lidija等[6]研究表明,黃酮與蛋白質的相互作用可影響蛋白質在體外抗氧化活性和消化率,對食品品質與健康性能產生多重影響。Yang等[7]使用多種光譜方法研究芥酸與牛血清白蛋白的相互作用,為芥酸過量攝入提供更多的臨床藥理信息。由多種原料復合而成的保健食品體系,其原料(特別是功效活性成分)在生產、貯藏中可能發(fā)生相互作用,導致產品成分、功效、感官品質等發(fā)生變化。因此,研究不同功效成分在不同條件下的相互作用對實際生產具有重要的指導意義。

骨質疏松是一種骨代謝疾病,是由于骨的吸收活躍強度高于骨的形成活動,而導致骨量減少、骨微結構退化。隨著我國人口老齡化進程的不斷加快,老年人的骨質疏松問題日益嚴重。因此,預防骨質疏松疾病的發(fā)生顯得尤為重要。雞軟骨肽,是以雞軟骨為原料,由生物可控酶解獲得的食源性活性肽,有助于改善關節(jié)軟骨健康,對骨質疏松的預防具有積極作用。杜仲是杜仲科植物杜仲(Eucommiaulmoides)的干燥樹皮,是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥,是一種傳統(tǒng)骨傷科用藥,具有增強骨密度、治療骨質疏松等作用。研究顯示,杜仲黃酮是杜仲促進骨細胞增殖、改善骨質疏松癥的主要有效成分之一[8-10],其含量是判斷杜仲生藥及其產品品質的重要指標[11]。

活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)積累是造成骨質疏松的關鍵因素[12]。ROS會干擾骨細胞對骨重建的啟動作用,還直接參與骨重建效應性細胞的調控,抑制成骨細胞分化,造成骨質疏松[13-14]。因此,ROS過剩造成氧化損傷與骨質疏松密切相關,使得抗氧化作用在防治骨質疏松的研究中越來越受到重視。

本文以杜仲黃酮和雞軟骨肽這兩種具有改善骨質疏松功效的物質為研究對象,模擬不同工藝生產和儲藏條件,考察不同條件下杜仲黃酮與雞軟骨肽相互作用前后抗氧化活性的變化,并通過熒光光譜對其相互作用機制進行初步的探討,以期為其在改善骨質疏松類保健食品中的開發(fā)和應用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲 四川新荷花中藥飲片股份有限公司;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH) 購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;蘆丁標品 購于國藥集團化學試劑有限公司;雞軟骨肽 無限極(中國)有限公司提供。

RE-52A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;UV754N紫外可見光分光光度計 INESA上海儀電分析儀器有限公司;SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新乏生物科技有限公司;BSZ-160F電腦自動部分收集器 上海精科實業(yè)有限公司;日立熒光光譜儀 天美(中國)科學儀器有限公司廣州分公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲黃酮類化合物的提取 將杜仲粉碎過60目篩,按1∶20 (g/mL)的料液比加入70%乙醇,在60 ℃的搖床中恒溫浸提3次,時間分別為3、2、1 h,收集并濃縮(于50 ℃恒溫旋轉蒸發(fā)濃縮)濾液至體積50 mL,冷凍干燥,即得杜仲黃酮粗提物[15]。

1.2.2 大孔樹脂分離純化杜仲黃酮 參考文獻[16]的方法,稍作修改。將95%乙醇浸泡保存的大孔樹脂D-101用蒸餾水沖洗至無醇味,用玻璃層析柱裝柱。稱取一定質量的杜仲黃酮粗提物,用蒸餾水溶解并經0.22 μm微孔濾膜過濾,得到總黃酮濃度0.8 mg/mL的杜仲黃酮溶液。用膠頭滴管上樣至層析柱(3.0 cm×20 cm)中,上樣體積20 mL。上樣后,先用蒸餾水沖洗,使樹脂充分吸附黃酮,并同時去除雜質(蛋白、多糖等)。沖洗約兩個柱體積后,先后用40%、60%、80%的乙醇進行梯度洗脫,用自動收集器收集,洗脫流速1 mL/min,5 mL/管,每個梯度收集60管。按1.2.3的方法檢測每管中的黃酮含量,根據吸光值繪制動態(tài)洗脫曲線,并收集峰段的黃酮組分,減壓濃縮至合適體積后,冷凍干燥并保存。

1.2.3 總黃酮含量測定 參考文獻[17],采用硝酸鋁顯色法,稍作修改。

標準曲線的繪制:準確稱取蘆丁標準品0.0500 g,用體積分數30%的乙醇溶解,定容至250 mL,得到質量濃度為C=0.2000 g/L的蘆丁標準溶液。精確稱取蘆丁標準溶液V1=0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0 mL于六只試管中,補加30%乙醇至3 mL,搖勻;各加入0.15 mL 5% NaNO2搖勻,放置5 min;各加入0.3 mL 10% AlCl3·6H2O搖勻,放置6 min;各加入1 mol/L NaOH 2.0 mL,混勻,補加0.55 mL 30%乙醇稀釋,總體積為V=6 mL,搖勻,10 min后,于波長510 nm處測定吸光值。參比為空白試劑。做三組平行。分別以標準品濃度及其對應吸光度作為橫縱坐標制作標準曲線,得線性回歸方程為y=9.6630x+0.0055(R2=0.9999),式中x為蘆丁標準品質量濃度(mg/mL),y為510 nm處的吸光值A510 nm。

總黃酮含量的測定:稱取一定質量經冷凍干燥處理的杜仲黃酮粗提物,用體積分數30%的乙醇溶解,稀釋至合適濃度,按照上述標準曲線的步驟測定吸光值,并將結果代入標準曲線計算得樣品中黃酮濃度。

1.2.4 杜仲黃酮與雞軟骨肽相互作用影響體系抗氧化活性的研究 以DPPH自由基清除率作為抗氧化指標,固定相互作用體系中雞軟骨肽濃度為5 mg/mL不變,探究不同物料配比、溫度、pH等因素對相互作用體系抗氧化效果的影響:

1.2.4.1 物料配比 固定雞軟骨肽濃度不變,用pH6.0的磷酸鹽緩沖液分別配制濃度9、12、15、18、21 μg/mL的杜仲黃酮,在室溫25 ℃下反應1 h,比較兩單獨組分的DPPH自由基清除率數學加和與相互作用后復合物的DPPH自由基清除率的顯著性關系,分析其抗氧化作用是否具有協(xié)同效果。

1.2.4.2 溫度 選擇1.2.4.1中具有顯著性差異的物料配比,并結合考慮食品在室溫貯藏及熱殺菌工藝中組分發(fā)生相互作用的可能性,在pH6.0條件下，研究在三個溫度條件(室溫:25 ℃下,反應1 h;低溫巴氏殺菌:68～70 ℃下,30 min;高溫殺菌:121 ℃下,20 min)處理后,DPPH自由基清除率的變化。

1.2.4.3 pH 參照1.2.4.1中選擇的物料配比,配置磷酸鹽緩沖液,模擬食品體系中酸堿性,研究在室溫下三個pH(5.5、6.0、6.5)下DPPH自由基清除率的變化。

1.2.5 DPPH自由基清除活性的測定 參考文獻[18],稍作修改。DPPH自由基濃度為0.2 mmol/L,用無水乙醇溶解,備用?？瞻渍{零Ao:用移液槍準確量取2 mL無水乙醇放入試管中,同時加入2 mL蒸餾水,重復三組;樣品Ai:用移液器準確量取樣品2 mL放入試管中,同時加入預先用無水乙醇配好的0.2 mg/mL的DPPH試劑2 mL,每個測試做2個重復;樣品Aj:在試管中先加入2 mL樣品,再加入2 mL乙醇,重復三組;對照組Ac:在試管中先加入2 mL乙醇,再加入2 mL DPPH溶液,重復三組。振動10 s,在37 ℃保溫30 min后,用分光光度計517 nm處測定吸光值。按照以下公式計算DPPH·清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.2.6 熒光光譜檢測 參考文獻[7, 19-20]，并稍作修改。采用熒光光譜法，探究杜仲黃酮與雞軟骨肽的相互作用。其中，杜仲黃酮樣品與雞軟骨肽均用磷酸鹽緩沖溶液預溶解，固定混合體系中雞軟骨肽濃度為0.2 mg/mL，改變杜仲黃酮濃度并使其在體系中濃度分別為0、0.40、0.80、1.60、3.20 μg/mL，兩者復配并在實驗溫度25 ℃及生理溫度37 ℃反應1 h，在激發(fā)波長280 nm下記錄樣品在295～500 nm波長范圍內的熒光發(fā)射光譜。

1.3 數據處理

所有數據均獨立平行測定3次,數據結果以平均值±標準差(mean±SD)的形式表示。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,采用Graphpad prism 6.0軟件對數據進行方差分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂柱層析純化杜仲黃酮

大孔樹脂用于分離純化黃酮主要是利用黃酮類物質的極性、分子大小、范德華力等物理吸附作用[16]。如圖1所示(先后用體積分數分別為40%、60%及80%的乙醇洗脫,各收集60管),40%乙醇洗脫峰相對集中,無明顯的拖尾現象。繼續(xù)增加洗脫液中乙醇體積分數(60%及80%),沒有明顯洗脫峰出現,可認為洗脫已基本完成。收集40%乙醇的洗脫組分,并真空濃縮至合適體積,冷凍干燥得到杜仲黃酮。

圖1 D-101樹脂柱層析動態(tài)洗脫杜仲黃酮曲線圖Fig.1 Dynamic elution of Eucommia ulmoides flavonoids by D-101 resin column chromatography

2.2 杜仲黃酮與雞軟骨肽相互作用對抗氧化活性的影響

ROS過剩造成的氧化損傷與骨質疏松密切相關,通過杜仲黃酮與雞軟骨肽交互作用對其抗氧化活性的影響,可一定程度上反映其在改善骨質疏松方面的功效變化情況。

2.2.1 物料配比對體系抗氧化活性的影響 實驗固定雞軟骨肽濃度5 mg/mL不變,梯度改變杜仲黃酮濃度,以探究不同物料配比對體系抗氧化活性的影響。由圖2可知,在不同物料配比下,雞軟骨肽與杜仲黃酮復合物的DPPH·清除活性顯著高于同濃度下兩者獨立體系清除活性的數學加和(p<0.01),說明復合體系中兩組分之間發(fā)生了相互作用,導致復合體系的抗氧化活性的升高,因此雞軟骨肽與杜仲黃酮復合體系的抗氧化活性具有協(xié)同增效的作用。在杜仲黃酮濃度小于15 μg/mL時,復合物的自由基清除活性隨著復合體系黃酮濃度的升高而顯著增大(p<0.05);而在杜仲黃酮濃度大于15 μg/mL時,隨著復合體系黃酮濃度的升高,復合物的自由基清除活性卻無明顯變化。

圖2 不同物料配比條件下雞軟骨肽-杜仲黃酮復合體系的抗氧化活性Fig.2 Effect of different material ratios on antioxidant activity注:**復合物與數學加和相比具有顯著性差異(p<0.01)；不同小寫字母表示不同黃酮濃度下復合物差異顯著(p<0.05)。

杜仲中黃酮類成分主要是槲皮素和山柰酚[21],其良好的抗氧化活性,一方面是由于結構上是一種酚羥基化合物,其酚羥基可通過供氫并與自由基反應而生成酚氧自由基,該酚氧自由基可與芳環(huán)形成共軛體系并穩(wěn)定存在,從而終止自由基鏈式反應[22];另一方面,活潑的酚羥基容易被氧化形成醌。多肽的抗氧化能力與組成該多肽的氨基酸種類、數量及排列方式相關。Lin等[23]從雞軟骨水解物中鑒定出5種新型多肽,由于組成上含有Tyr、Lys及Pro三種抗氧化性氨基酸,雞軟骨肽具有較強的抗氧化能力。多肽與黃酮的作用主要是非共價疏水相互作用,非共價力通常包括氫鍵、疏水鍵、范德華力,而肽-黃酮復合物的產生是氫鍵和疏水鍵形成的結果[5-6]。雞軟骨肽在一定濃度下,隨著加入杜仲黃酮濃度的增加,肽與黃酮相互作用效果增強,因此復合體系中抗氧化活性明顯增強,呈現明顯的劑量效應關系。但當黃酮數量增加到一定程度后,其與肽的相互作用逐漸趨向飽和,因此復合體系的抗氧化活性逐漸趨向于穩(wěn)定,不再發(fā)生顯著性變化。

2.2.2 溫度及pH對復合體系抗氧化活性的影響 固定體系中雞軟骨肽與杜仲黃酮濃度分別為5 mg/mL和15 μg/mL不變,探究實際工藝生產中溫度及pH對相互作用的影響。

如圖3a所示,杜仲黃酮的DPPH自由基清除活性對溫度不敏感,在結構上相對穩(wěn)定。但是,溫度可能影響多肽的空間結構,在高溫環(huán)境下肽鏈得以伸展,抗氧化性氨基酸殘基暴露,與巴氏殺菌相比，在121 ℃下20 min后雞軟骨肽的DPPH自由基清除活性顯著增強,但在巴氏殺菌溫度條件下卻相對穩(wěn)定。雞軟骨肽-杜仲黃酮復合物在巴氏殺菌溫度條件下也相對穩(wěn)定,其DPPH自由基清除活性沒有發(fā)生顯著性變化,但在高溫殺菌溫度條件下的DPPH自由基清除活性顯著升高(p<0.01)。其原因可能在于,溫度會影響氫鍵和疏水鍵的形成,多肽鏈伸展,疏水基團暴露,有利于增加多肽與黃酮的疏水性相互作用[24-25]。高溫長時殺菌,一方面可以明顯增加相互作用產物的抗氧化活性,另一方面對延長食品貨架期也有一定的幫助。

圖3 不同溫度(a)及pH(b)對雞軟骨肽-杜仲黃酮相互作用的影響Fig.3 Effect of different temperatures (a)and pH(b)on interaction注:a與25 ℃組相比具有顯著性差異,**p<0.01;與68 ℃組相比具有顯著性差異,##p<0.01；b與pH5.5組相比具有顯著性差異,**p<0.01; 與pH6.0組相比具有顯著性差異,##p<0.01。

由圖3b可知,雞軟骨肽的DPPH自由基清除活性對pH反應不敏感,隨pH的改變沒有顯著性變化;杜仲黃酮在pH6.5時的DPPH自由基清除活性較pH6.0時顯著下降(p<0.01),而與pH5.5時的DPPH自由基清除活性沒有顯著性差異;肽-黃酮復合物在5.5、6.0兩個pH條件下的DPPH·清除活性顯著高于pH6.5時的DPPH自由基清除活性(p<0.01)。可能是由于黃酮本身是一種酚羥基化合物,其酚羥基在正常條件下能發(fā)生解離而生成酚氧陰離子及氫離子,故呈現出一定的酸性。低pH可在一定程度上抑制酚羥基的解離,并且不利于酚羥基供氫參與自由基反應,由此導致黃酮抗氧化能力降低[26]。在較低pH條件下,肽由于氨基酸的解離而擁有更多的結合位點,肽與黃酮通過疏水相互作用結合的幾率增加,利于兩者的絡合[27]。因此,在食品酸性體系中,合適的pH環(huán)境有利于增強雞軟骨肽-杜仲黃酮復合體系的抗氧化活性。

2.3 杜仲黃酮對雞軟骨肽的熒光特性的影響

熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段[28]。蛋白質的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基,可在一定激發(fā)波長下產生熒光效應。在蛋白質溶液中加入黃酮等小分子物質后,可能引起蛋白內源性熒光強度的降低,造成熒光猝滅的現象。因此,通過檢測杜仲黃酮與雞軟骨肽相互作用前后熒光特性的變化情況,可以進一步探究杜仲黃酮對雞軟骨肽的作用。

固定雞軟骨肽濃度為0.2 mg/mL,探究不同濃度的杜仲黃酮對雞軟骨肽熒光發(fā)射光譜的影響。如圖4a和4b所示,杜仲黃酮的加入可使雞軟骨肽的熒光強度明顯下降,并且隨著黃酮濃度的增加(圖中箭頭所示方向),效果越明顯。說明,杜仲黃酮對雞軟骨肽的內源熒光有明顯的猝滅作用,并且隨黃酮濃度的增加,熒光猝滅效果越明顯。溫度變化并未引起復合物發(fā)射峰峰形的改變,說明黃酮對多肽的熒光猝滅方式可能表現為靜態(tài)猝滅。同時,隨著杜仲黃酮添加量的增加,肽的熒光最大發(fā)射峰出現了明顯的紅移。說明,杜仲黃酮與雞軟骨肽發(fā)生相互作用形成復合物,可能是兩者間氫鍵和疏水鍵形成的結果[6,24],從而導致其熒光性質的改變。

圖4 杜仲黃酮對雞軟骨肽熒光光譜的影響Fig.4 Effect of Eucommia ulmoides flavonoids on fluorescence spectra of chicken cartilage peptides注:箭頭方向表示杜仲黃酮濃度逐漸增加，依次為0、0.40、0.80、1.60、3.20 μg/mL。

3 結論

杜仲黃酮可與雞軟骨肽發(fā)生相互作用,使復合體系的抗氧化活性得到明顯增強,并且在一定的物料配比范圍內呈現明顯的劑量效應關系。溫度和pH對雞軟骨肽-杜仲黃酮的相互作用會產生明顯的影響。在巴氏殺菌條件下復合體系的抗氧化活性并無明顯變化,但在121 ℃下20 min后復合體系的抗氧化活性呈現明顯的協(xié)同增效作用。環(huán)境pH的升高不利于復合體系抗氧化活性,在pH6.0條件下肽-黃酮復合體系的抗氧化活性增強。杜仲黃酮能猝滅雞軟骨肽的內源性熒光,并使其最大熒光發(fā)射峰出現明顯紅移,說明兩者發(fā)生明顯的相互作用。本研究為杜仲黃酮和雞軟骨肽在改善骨質疏松保健食品中的開發(fā)和應用提供一定的參考,對不同食品組分相互作用的研究也具有一定的參考價值。