吳子健，石振鵬，侯惠靜，姜帆

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，天津301700）

蛋白質(zhì)分子中的ε-氨基與多糖還原性末端上的羰基之間可在一定條件下自發(fā)形成蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物，能夠顯著提高蛋白質(zhì)的功能性（如：水溶性、乳化性、熱穩(wěn)定性等），反應(yīng)通常加熱處理，而無(wú)需添加其他的化學(xué)試劑，屬于“綠色加工工藝”[1]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在生物化學(xué)及其他相關(guān)方面的研究中常作為一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白來(lái)使用[2]，同時(shí)也是一種天然的營(yíng)養(yǎng)素載體，而通過(guò)糖基化改性，可進(jìn)一步提高其乳化活性，改善其對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的包埋效果，BSA糖基化后，可在乳化過(guò)程中快速移動(dòng)到油水界面，并在界面展開重排，對(duì)于包埋油溶性的營(yíng)養(yǎng)素具有很好的效果[3-4]。

常用糖基化改性方法主要有兩種，即干熱法及濕熱法。Cheetangdee N等[5]采用干熱法制備β-乳球蛋白-己糖接枝物，提高其在等電點(diǎn)處的乳化活性；李海明[6]采用濕熱法制備玉米醇溶蛋白-葡萄糖（或木糖）接枝產(chǎn)物，顯著提高了玉米醇溶蛋白的親水性。本研究以乳化活性為指標(biāo)，優(yōu)化濕法美拉德反應(yīng)制備牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物的工藝，并對(duì)葉黃素進(jìn)行包埋，檢測(cè)其對(duì)油溶性分子的包埋效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白Ⅴ（分子量68 kDa）：Solarbio公司；葡聚糖（分子量20 kDa）：MACKLIN公司；溶菌酶標(biāo)品（14.3 kDa）、卵清蛋白標(biāo)品（44.3 kDa）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)品（77.9 kDa）、甲狀腺球蛋白標(biāo)品（165 kDa）：sigma aldrich公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；去離子水、超純水為天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

T 10 basic ULTRA-TURRAX小型分散機(jī)：德國(guó)IKA公司；SIM-F140BDL制冰機(jī)：日本Panasonic公司；3-18K離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；Seven Excellence pH計(jì)、UV-5紫外可見分光光度計(jì)：瑞士METTLER公司；2000 ES全自動(dòng)四元梯度高效液相色譜儀：美國(guó)科學(xué)公司；FD-5N真空冷凍干燥機(jī)：日本EYELA公司；PROTEIN KW-803分子凝膠色譜柱（300 mm，8.0 mm×5 μm）：日本SHIMADZU公司；SE 260垂直電泳系統(tǒng)：美國(guó)Hoefer公司；Essential V6凝膠成像系統(tǒng)：英國(guó)U－vitec公司；AH100B高壓均質(zhì)機(jī)：加拿大ATS公司；Ariummini plus純水機(jī)：德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 BSA-dextran接枝物的制備

參考Jiang Z等[7]的方法并做調(diào)整：將葡聚糖（dextran）與BSA按一定摩爾比混合，溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后，樣品冰浴下冷卻，4℃下離心（4 500 g，15min）取上清，上清液再在4.0℃下透析24 h（分子截留量為20 kDa±0.2 kDa），最后凍干，產(chǎn)物即為牛血清白蛋白-葡聚糖接枝物（BSA-dextran，DBSA）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)物配比、BSA濃度、緩沖液體系pH值為單因素，以反應(yīng)后DBSA接枝物的乳化活性為響應(yīng)值，優(yōu)化生成DBSA接枝物的反應(yīng)條件。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的原理[8]，以 BSA濃度（A）、底物配比（B）、緩沖液體系 pH值（C）、時(shí)間（D）、溫度（E）為自變量，以產(chǎn)物乳化活性（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)五因素三水平共46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中6個(gè)為中心零點(diǎn)試驗(yàn)，40個(gè)為析因試驗(yàn)。零點(diǎn)為區(qū)域的中心值，析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C、D、E所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)。將因素的上下水平編碼為1、-1，具體因素編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in central composite design

1.3.4 乳化活性的測(cè)定

乳化活性的測(cè)定參考吳鵬等[9]的方法并做調(diào)整，取1.0 mL糖蛋白溶液（2.0 mg/mL）與200.0 μL大豆油混合，16 000 r/min條件下勻漿1.0 min后，立即從底部吸取100.0 μL勻漿液，置于5 mL SDS溶液（0.1%）中，然后迅速振蕩混勻，并在500 nm處測(cè)定吸光度（以0.1%SDS溶液為空白）。乳化活性（emulsifying ability index，EAI）按公式（1）計(jì)算。

式中：A500為乳狀液吸光度值；n為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ=0.2）。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

參考Bu G等[10]的方法：分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，蛋白上樣濃度1.0 mg/mL，上樣量7.0 μL，電泳電壓200 V，電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R-250染色，再經(jīng)脫色后拍照。

1.3.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法

采用Bhatia M等[11]的方法并做調(diào)整：分子凝膠色譜柱（PROTEIN KW-803，300 mm，8.0 mm×5 μm）蛋白樣品濃度2.0 mg/mL，進(jìn)樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相0.3 mol/L NaCl（0.05 mol/L PBS 緩沖液，pH 6.80），時(shí)間 0～18 min。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白采用溶菌酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白Ⅴ、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺球蛋白，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，蛋白分子量的ln值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 葉黃素包埋顆粒的制備

乙醇注入-高壓均質(zhì)法[12]制備葉黃素包埋顆粒：將BSA和DBSA分別溶于去離子水中，蛋白濃度為2mg/mL，充分溶解后再葉黃素乙醇溶液逐滴加入BSA或DBSA溶液中，使得每100 mL蛋白溶液中含葉黃素2 mg，充分混勻1.0 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（加熱溫度55.0℃）除去乙醇后，冰浴冷卻后并用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至4.70，然后高壓均質(zhì)（85 000 kPa條件下，循環(huán)3次），于4.0℃下靜置12 h，即得載有葉黃素的包埋顆粒，最后將上述葉黃素蛋白均質(zhì)液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得固體的牛血清白蛋白-葉黃素包埋顆粒（bovine serum albumin-lutein，BSA-lutein）和牛血清白蛋白-葡聚糖-葉黃素包埋顆粒（bovine serum albumin-dextran-lutein，DBSA-lutein）。

葉黃素的包封率按照如下的公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

游離葉黃素含量通過(guò)有機(jī)溶劑洗滌法[13]測(cè)定：取0.5 mL的BSA-lutein或DBSA-lutein，加入2.0 mL正己烷，充分混合，7 000 r/min下離心5 min，并收集上層有機(jī)相。重復(fù)2次該操作，合并有機(jī)相，測(cè)定其在448 nm處的吸光值。以不同濃度葉黃素（正己烷溶解）在448 nm處吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.822x+0.016，R2=0.99），計(jì)算出游離葉黃素的含量。

總?cè)~黃素含量通過(guò)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）增溶法[14]測(cè)定：取 0.5 mL 的 BSA-lutein或DBSA-lutein，加入SDS（終濃度為0.3 mol/L）溶液充分振蕩混合，30.0℃孵育5 min，測(cè)定其在448 nm處的吸光值，以不同濃度葉黃素（SDS溶解）在448 nm處吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=28.89x-0.013，R2=0.99）計(jì)算出包埋顆粒中葉黃素的總含量。

1.3.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，并運(yùn)用Origin 8.0與SPSS 17.0進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)分析；響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕法接枝反應(yīng)條件對(duì)DBSA乳化活性的影響

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)DBSA乳化活性的影響

控制緩沖液體系pH值為7.50，BSA濃度2.0mg/mL，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）3.5∶1，反應(yīng)時(shí)間為3.0 h，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度為 80.0、85.0、90.0、95.0、100.0℃，研究所得產(chǎn)物DBSA的乳化活性變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度對(duì)DBSA乳化活性的影響Fig.1 Effects of temperature on emulsifying activity of DBSA

隨著反應(yīng)體系溫度的升高，DBSA的乳化活性逐漸升高，當(dāng)體系溫度達(dá)到90.0℃時(shí)，其乳化活性最好，為24.67 m2/g；當(dāng)溫度高于90.0℃時(shí)，乳化活性顯著降低（P＜0.05）。這可能是因?yàn)楦邷胤磻?yīng)時(shí)，部分BSA迅速聚集沉淀，導(dǎo)致溶解度降低，從而使得乳化活性下降。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DBSA乳化活性的影響

控制反應(yīng)體系溫度90.0℃，緩沖液體系pH值為7.50，BSA 濃度 2.0 mg/mL，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）3.5∶1，調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間為 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，研究所得產(chǎn)物DBSA的乳化活性變化，結(jié)果如圖2所示。

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DBSA的乳化活性逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.0h時(shí)，其乳化活性最好，為25.59 m2/g，與未反應(yīng)BSA的乳化活性（16.98 m2/g）相比，提高了0.5倍；但是隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步增加，DBSA的乳化活性顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于蛋白質(zhì)引入的糖鏈過(guò)多，致使蛋白質(zhì)過(guò)度親水，失去親水親油平衡，導(dǎo)致乳化活性的下降[14]。

圖2 時(shí)間對(duì)DBSA乳化活性的影響Fig.2 Effects of time on emulsifying activity of DBSA

2.1.3 底物配比對(duì)DBSA乳化活性的影響

控制反應(yīng)體系溫度為90.0℃，反應(yīng)時(shí)間2.0 h，緩沖液體系pH值為7.50，BSA濃度2.0 mg/mL，調(diào)節(jié)底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）為 1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1，研究所得產(chǎn)物DBSA的乳化活性變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物配比對(duì)DBSA乳化活性的影響Fig.3 Effect of the raito of dextran to BSA on emulsifying activity of DBSA

隨著底物配比中dextran含量的增加，DBSA的乳化活性先降低后升高：這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锱浔葹?∶3時(shí)，反應(yīng)體系中BSA含量較高，即使反應(yīng)程度較低，測(cè)得乳化活性值仍較高；當(dāng)?shù)孜锱浔葹?∶1的時(shí)候，DBSA乳化活性最好，為26.9 m2/g，顯著高于底物配比為1∶3 時(shí) DBSA 的乳化活性（25.12 m2/g）（P＜0.05），說(shuō)明通過(guò)接枝反應(yīng)可以使得相同摩爾質(zhì)量的BSA的乳化活性得到進(jìn)一步的提高；但是當(dāng)dextran含量進(jìn)一步增加后，乳化活性反而降低。這可能是因?yàn)槿芤褐衐extran含量過(guò)高，使得溶液黏度過(guò)大，流動(dòng)性變差，不利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生[15]。

2.1.4 BSA濃度對(duì)DBSA乳化活性的影響

控制反應(yīng)體系溫度為90.0℃，反應(yīng)時(shí)間為2.0 h，緩沖液體系pH值為7.50，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）5∶1，調(diào)節(jié) BSA 濃度為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL，研究所得產(chǎn)物DBSA的乳化活性變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 BSA濃度對(duì)DBSA乳化活性的影響Fig.4 Effect of the concentration of protein on emulsifying activity of DBSA

隨著BSA濃度的增加，DBSA的乳化活性先升高后降低：當(dāng)BSA濃度為2.0 mg/mL時(shí)，DBSA乳化活性最好（P＜0.05），為 26.83 m2/g；BSA 濃度繼續(xù)增大，其乳化活性反而降低，這與Viviane D的研究結(jié)果一致[16]。

2.1.5 緩沖液體系pH值對(duì)DBSA乳化活性的影響

控制反應(yīng)體系溫度為90.0℃，反應(yīng)時(shí)間2.0 h，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）為 5∶1，BSA 濃度 2.0 mg/mL，調(diào)節(jié)緩沖液體系 pH 值為 6.50、7.00、7.50、8.00、8.50，研究所得產(chǎn)物DBSA的乳化活性變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH對(duì)DBSA乳化活性的影響Fig.5 Effects of pH on emulsifying activity of DBSA

隨著緩沖液體系pH值的增加，DBSA的乳化活性逐漸增大，當(dāng)pH值為8.00時(shí)，DBSA乳化活性最好（P＜0.05），為 27.32 m2/g；pH 值繼續(xù)增大，DBSA 乳化活性開始下降，這與Ho Y T等[17]的研究結(jié)果一致。

2.1.6 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)表1所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案，通過(guò)Design-Expert 8.0軟件計(jì)算出實(shí)際水平[18]。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design results of Box-Behnken

2.1.7 模型建立及顯著性分析

使用Design-Expert 8.0軟件，以Y（乳化活性）對(duì)表2中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到的二次回歸模型方程如下：Y=25.79+3.34 A+2.11 B+4.22 C-0.7D+0.95E-0.47AB+0.94AC-0.37AD-0.86AE+1.07BC+0.45BD+1.96BE+0.67CD+0.69CE+0.95DE-1.85A2-2.60B2-2.60C2-1.78D2-0.81E2。該模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

回歸方程模型的F檢驗(yàn)顯著，失擬項(xiàng)不顯著，這表明其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該模型能較好地反映數(shù)據(jù)。證明用此模型進(jìn)行對(duì)DBSA乳化活性的優(yōu)化是可行的。其中BSA濃度（A），底物配比（B），pH值（C）對(duì)乳化活性的影響為極顯著，溫度（E）對(duì)乳化活性的影響為顯著，時(shí)間（D）對(duì)乳化活性的影響不顯著；交叉項(xiàng)只有BE對(duì)乳化活性的影響為顯著；平方項(xiàng)A2，B2，C2，D2對(duì)乳化活性的影響為極顯著。交叉作用顯著的因素的曲面圖和等高線圖如圖6所示。

圖6 底物配比和溫度相互作用對(duì)乳化活性的影響Fig.6 Effect of substrate ratio and temperature interaction on emulsifying activity

2.1.8 最佳接枝產(chǎn)物工藝參數(shù)

根據(jù)模型求響應(yīng)面的極值點(diǎn)，理論最佳條件為BSA 濃度 2.78 mg/mL，dextran∶BSA（摩爾比）=6.89∶1，pH值8.50，反應(yīng)時(shí)間2.3 h，反應(yīng)溫度95.0℃，乳化活性最高為32.138 m2/g。以該最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)3次，乳化活性為（31.743±0.45）m2/g，與預(yù)測(cè)值接近。這表明該具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.2 接枝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 SDS-PAGE分析

DBSA電泳圖譜結(jié)果如圖7所示。

隨著濕法美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，BSA的特征條帶逐漸變淺，而在分離膠頂端出現(xiàn)兩條明顯的蛋白條帶，這表明有大分子量的糖蛋白形成，出現(xiàn)兩條分子量不同的蛋白，可能是由于BSA的接枝度不同導(dǎo)致的，且隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步增加，分子量低的糖蛋白逐漸減少，分子量高的糖蛋白逐漸增多。

2.2.2 HPLC分析

為了進(jìn)一步研究所形成的糖蛋白的分子量，采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的ln值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。

圖7 牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of BSA-Dextran Graft Product

圖8 高效液相色譜洗脫時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of clution time of HPLC

回歸方程為y=-0.592x＋15.39，R2=0.987，蛋白質(zhì)分子量范圍在14 kDa～165 kDa內(nèi)線性關(guān)系良好。BSA及DBSA的液相圖譜如圖9所示。

圖9 牛血清白蛋白及接枝產(chǎn)物HPLC圖Fig.9 HPLC of BSA and DBSA

由文獻(xiàn)[19]可知，蛋白質(zhì)的分子量越大，保留時(shí)間越短，BSA的保留時(shí)間為7.182 min，DBSA的保留時(shí)間為5.853 min，表明了大分子量的糖蛋白生成，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到新的糖蛋白的分子量約為152 kDa。

2.3 葉黃素包埋顆粒的包封率

圖10為經(jīng)過(guò)乙醇注入-高壓均質(zhì)法制備的蛋白-葉黃素包埋顆粒的凍干粉末。

圖10 蛋白-葉黃素包埋顆粒的照片F(xiàn)ig.10 Picture of BSA-lutein and DBSA-lutein embedded particles

BSA-lutein粉末顏色為淡黃色，DBSA-lutein相較于BSA-lutein黃色更深，二者復(fù)溶后，僅從感官上觀察不出區(qū)別，但與lutein相比，二者在水中的溶解度有著明顯的提高，且溶液在放置一周后，BSA-lutein溶液底部會(huì)觀察到沉淀，說(shuō)明葉黃素包埋顆粒聚集形成了大粒子而沉淀，但DBSA-lutein溶液則仍能保持均勻，這證明了蛋白質(zhì)在與葡聚糖發(fā)生接枝反應(yīng)后能夠減少了顆粒的聚集，提高葉黃素的穩(wěn)定性[20]。根據(jù)1.3.7中的方法計(jì)算得：接枝后，DBSA-lutein的包封率達(dá)到95.86%，高于BSA-lutein的77.82%，這與試驗(yàn)預(yù)期的情況相符。

3 結(jié)論

本文以乳化活性為指標(biāo)，通過(guò)單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化濕法美拉德反應(yīng)制備牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物的工藝，得到的二次回歸模型方程經(jīng)檢驗(yàn)證明是合理可靠的。其中各因素對(duì)乳化活性影響的大小關(guān)系為pH值＞BSA濃度＞底物配比＞溫度＞時(shí)間，最佳工藝參數(shù)為BSA濃度2.78 mg/mL、dextran∶BSA（摩爾比）=6.89∶1、pH 8.50、反應(yīng)時(shí)間 2.3 h、反應(yīng)溫度 95.0 ℃，此時(shí)制得的接枝產(chǎn)物乳化活性為（31.743±0.45）m2/g，分子量約為152 kDa，純度為89.449%。使用DBSA制備的葉黃素包埋顆粒的包封率達(dá)到95.86%。