常婭妮，王亞嵐，李玲

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

酸木瓜（Chaenomeles sinensis）是一種古老的水果樹上結(jié)出的果子，屬于被子植物門雙子葉植物綱薔薇科木瓜屬，也被稱作木梨或者光皮木瓜，是云南特產(chǎn)，特別是在大理栽植廣泛，是集藥用、食用和觀賞為一體的果實(shí)，有一種特殊的香味，色澤金黃，營養(yǎng)極其豐富。酸木瓜中的主要元素都是有益于人體的，如酸木瓜中特有的木瓜蛋白酶，它能將脂肪轉(zhuǎn)化為脂肪酸，可以促進(jìn)脂肪的消化和吸收，也可以幫助脾臟消化，酸木瓜中特有的木瓜生物堿也具有抗菌和抵制腫瘤的作用[1]。酸木瓜中還含有具有保護(hù)肝臟、抵抗炎癥、抑制細(xì)菌、降低血脂、預(yù)防肝硬化、抗衰老、軟化血管等功能[2]的齊墩果酸。酸木瓜還可以制作成為果酒、泡酒[3-4]、果脯[5]、木瓜牛奶、木瓜飲料[6-7]等，同時(shí)也能用來制作美味佳肴，在大理地區(qū)用酸木瓜做成的酸木瓜雞、酸木瓜魚等，滋味非?？煽?。酸木瓜也是一種可以健脾、開胃、舒通筋骨、祛風(fēng)寒除濕氣、減輕疼痛，醫(yī)治和防止風(fēng)濕病和缺乏維生素C癥的藥物。黃酮類物質(zhì)廣泛的存在于生物體中，它擁有較強(qiáng)的生物活性和藥物活性，許多研究表明，酸木瓜中的黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化作用和增強(qiáng)血管彈性、降血壓、預(yù)防心律失常等效用[8]。近年來隨著人們生活水平的提高，飲食健康問題日益被大家看重，尤其富含各種抗氧化成分的食物更是備受青睞，它們的保健藥用價(jià)值與其所含的抗氧化成分關(guān)系密不可分，所以以天然食材為原料開發(fā)各種食品級抗氧化劑等保健產(chǎn)品勢在必行[9-14]。

超聲波在液體中具有空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，這些效應(yīng)可以加快植物中有效成分的溶出，從而加速植物活性組分的提取[15]，超聲波乙醇輔助法能夠更加高效、便捷和低污染的提取植物中的活性成分。目前利用超聲波從植物中提取精油[16]、皂素[17]、蛋白質(zhì)[18]、黃酮類等活性物質(zhì)的研究較多，但是以酸木瓜為原料利用超聲波提取黃酮類物質(zhì)的研究較少，且沒有從酸木瓜果皮、果肉和籽中分別提取黃酮類物質(zhì)的研究。因而本文分別以酸木瓜的果皮、果肉、籽為原料，選取超聲波的超聲功率、提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，考察酸木瓜不同部位的總黃酮含量差異情況，并選取總黃酮含量較多的部位進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到在酸木瓜中提取總黃酮的最優(yōu)工藝條件，為酸木瓜中黃酮類物質(zhì)的高效提取和酸木瓜果皮、果肉和籽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸木瓜：產(chǎn)自云南大理，選取大小適中的新鮮青果，果重約為250g/個(gè)，4℃冷藏備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京百靈科技有限公司；95%乙醇、無水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2（分析純）：天津康科德有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3200S紫外分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；SorvallTM ST16高速離心機(jī)：德國Thermo Fisher Scientific公司；JRA-650T超聲波提取機(jī)：無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；WF-B高速萬能粉碎機(jī)：科威機(jī)械（上海）有限公司；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱、BPZ-6120-2B真空干燥箱：上海恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

參照了馬文兵等[19]的方法和2010年版《中華人民共和國藥典》[20]，精準(zhǔn)稱取0.024 7 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，在105℃下利用真空干燥箱干燥4 h至重量穩(wěn)定不變，再溶解于適量的70%乙醇中，為了使其充分溶解，可以轉(zhuǎn)至超聲波清洗器中適當(dāng)超聲，待完全溶解后再轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中并定容至刻度，得到的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.247（mg/mL）。

1.3.2 酸木瓜中總黃酮的提取工藝

酸木瓜樣品洗凈，切碎后，將新鮮的酸木瓜肉、皮、籽放在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50℃下烘干至恒重，用高速粉碎機(jī)分別粉碎酸木瓜果肉、果皮、籽，60目過篩備用。精確稱取酸木瓜果皮、籽各1 g和酸木瓜果肉2 g放置于容量為50 mL的錐形瓶中，在不同條件下超聲取提，將獲得的提取物進(jìn)行離心、降壓抽取過濾，收集濾液。為了充分提取酸木瓜的總黃酮成分，應(yīng)重復(fù)操作兩次，合并濾液靜置后，取上清液備用，使用70%的乙醇溶液定容，即得到酸木瓜果皮、果肉和籽的樣液。

1.3.3 測定方法

利用黃酮類物質(zhì)在Al（NO3）3與亞硝酸鹽的作用下產(chǎn)生絡(luò)合物，且在堿性環(huán)境中顯色的特性，采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法[21]，選擇吸收峰較大的510 nm處波長[22]，用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酸木瓜樣液顯色完畢后，在510 nm波長下測其吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮的質(zhì)量濃度，并計(jì)算其總黃酮得率：

式中：C為酸木瓜提取液的濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為最初的定容容積，mL；m為酸木瓜的干粉質(zhì)量，g。

重復(fù)操作3次取平均值。

1.3.4 單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

影響超聲波乙醇輔助法提取酸木瓜中總黃酮的主要因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、料液比、超聲功率等，因此，在固定超聲溫度60℃的條件下，以提取出的目標(biāo)物得率為指標(biāo)，分別對這4種影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素及水平對酸木瓜果皮、果肉和籽的總黃酮得率的影響。

1.3.4.1 料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），分別按酸木瓜與乙醇溶液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為 60%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下超聲30 min提取酸木瓜中的總黃酮，考察料液比對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下超聲30 min提取酸木瓜中的總黃酮，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.3 超聲波提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別在超聲功率132、165、198、231、264 W 的條件下超聲 30 min 提取酸木瓜中的總黃酮，考察超聲功率對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.4 超聲波提取時(shí)間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率影響的設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下分別超聲提取 10、20、30、40、50 min，考察超聲時(shí)間對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇總黃酮得率較高的酸木瓜部位，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出各因素3個(gè)較好的水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步去考察這4個(gè)因素，以期得到最優(yōu)的提取工藝條件，因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最大吸收波長510 nm下，確定以不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值A(chǔ)510為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=10.509x+0.011 1（R2=0.999 3），見圖 1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 料液比對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on total flavonoids yield in sour papaya

由圖2可以看出總黃酮得率在酸木瓜與乙醇溶液混合比為 1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）時(shí)，隨著乙醇溶液所占比例的的增大總黃酮得率也增加，當(dāng)酸木瓜與乙醇溶液的比例增至1∶25（g/mL）時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高，此時(shí)酸木瓜果皮中總黃酮得率為6.42%，果肉中總黃酮得率為4.71%，籽中總黃酮得率為2.87%，當(dāng)乙醇溶液所占的比例繼續(xù)增大時(shí)總黃酮得率均下降。田勇等[23]從昆侖胎菊中提取黃酮類物質(zhì)時(shí)也遇到類似的情況，這可能是因?yàn)殡S著乙醇添加量的增加，很多其它可以溶于乙醇的物質(zhì)大部分溶出，阻礙了酸木瓜中總黃酮的溶出，而且溶劑使用量的適度增加有利于酸木瓜中總黃酮的溶解，但是溶劑使用量過大會不利于后期提取液的降壓抽濾提純[24]，從而導(dǎo)致酸木瓜中總黃酮得率降低，因此提取酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮的最佳料液比是1∶25（g/mL）。

2.3 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

乙醇的體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of alcohol volume fraction on total flavonoids yield in sour papaya

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率也逐漸增加。如圖3所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率均達(dá)到最大，此時(shí)果皮中總黃酮得率為7.03%，果肉中總黃酮得率為5.16%，籽中總黃酮得率為3.49%，而當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，酸木瓜中的總黃酮得率均下降。這一方面是由于黃酮類物質(zhì)是極性化合物，當(dāng)乙醇溶液濃度較小時(shí)，極性較大，這樣黃酮類物質(zhì)就會較易溶于乙醇溶劑里，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，其極性減弱，從而與黃酮類物質(zhì)的極性相近程度降低，因此減少了酸木瓜中總黃酮的溶出[25]。另一方面是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酸木瓜中一些易溶于乙醇的脂溶性物質(zhì)、糖類物質(zhì)、色素等副產(chǎn)物流出，這些副產(chǎn)物會與提取液體系合并，阻礙黃酮類化合物從酸木瓜中溶出，使得總黃酮得率下降，在一些報(bào)道中從其他原材料中提取黃酮類物質(zhì)也有同類現(xiàn)象[26]，因此提取酸木瓜中總黃酮的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)是60%。

2.4 超聲波的提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

超聲波的提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield in sour papaya

由圖4可知，酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率均隨著超聲波提取功率的增加呈先升后降的趨勢，這種趨勢在其他文獻(xiàn)中也均有出現(xiàn)[27]，當(dāng)超聲功率為198 W時(shí)，酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率均達(dá)到最大，此時(shí)酸木瓜果皮中總黃酮得率為7.22%，酸木瓜果肉中總黃酮得率為6.07%，酸木瓜籽中總黃酮得率為3.93%，當(dāng)超聲波提取功率超過198 W時(shí)，總黃酮得率均下降，這可能是由于隨著超聲波功率變大，超聲波的輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的擾動效應(yīng)、破碎和混合攪拌作用、空化作用等多級效應(yīng)變得更加強(qiáng)烈，從而分子的運(yùn)動速度和頻率就會變得更快，溶劑的穿透能力變得更強(qiáng)，加強(qiáng)了黃酮類物質(zhì)的溶出[28]，但是當(dāng)超聲波提取功率達(dá)到一定范圍時(shí)，因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的能量較大，導(dǎo)致物料內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)崩潰，造成了超聲波的擾動、空化等效應(yīng)變小[29]，因而隨著超聲波功率逐漸升高，酸木瓜中總黃酮的得率逐漸降低，所以超聲波提取功率198 W是提取酸木瓜中總黃酮的最佳提取功率。

2.5 超聲波提取時(shí)間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率的影響

超聲波提取時(shí)間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on total flavonoid yield in sour papaya

如圖5所示，在超聲提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大，此時(shí)酸木瓜果皮、果肉、籽中的總黃酮得率分別為7.2%、3.64%、3.53%，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，總黃酮得率均下降。這可能是由于超聲時(shí)間在10 min～30 min范圍內(nèi)時(shí)，提取時(shí)間過短，黃酮類物質(zhì)還沒有被全部提取出來，從而黃酮得率隨著提取時(shí)間的增加而上升，但是隨著提取時(shí)間的增加，酸木瓜中的總黃酮有一部分被分解或氧化，導(dǎo)致了目標(biāo)產(chǎn)物總黃酮的得率降低[30]。除此之外長時(shí)間的超聲會使得總黃酮得率向極值靠近，同時(shí)也會使提取物中雜質(zhì)的含量增加，目標(biāo)物含量反而也會降低[31]，因此超聲波提取時(shí)間30 min是酸木瓜中總黃酮的最佳提取時(shí)間。

2.6 提取酸木瓜果皮中總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同提取條件下酸木瓜果皮中的總黃酮得率均高于果肉和籽中的總黃酮得率，所以選擇酸木瓜果皮進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，目的是為了進(jìn)一步去探究超聲時(shí)間、超聲功率、料液比和乙醇的體積分?jǐn)?shù)對酸木瓜果皮中總黃酮得率的影響，確定最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2可知影響酸木瓜果皮中總黃酮得率的因素順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞液料比＞超聲功率＞乙醇的體積分?jǐn)?shù)，提取酸木瓜果皮中總黃酮的最優(yōu)工藝組合為A2B2C3D1，即超聲時(shí)間為25 min，超聲功率為231 W，料液比為1∶25（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。由表3可知超聲時(shí)間對酸木瓜果皮中總黃酮得率影響顯著。為了確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，用正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)得到酸木瓜皮中總黃酮得率為（7.31±0.38）%，表明試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，因此該提取工藝條件合理。

3 結(jié)論

采用超聲波乙醇輔助法提取酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮，得到較好的提取效果，經(jīng)過單因素試驗(yàn)可知，酸木瓜果皮、果肉、籽的總黃酮得率依次為：酸木瓜果皮＞酸木瓜果肉＞酸木瓜籽，說明酸木瓜中的總黃酮主要存在于果皮部位，所以選擇酸木瓜果皮進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明不同提取因素對酸木瓜果皮中總黃酮得率的影響順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞液料比＞超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，最優(yōu)提取條件為：超聲時(shí)間25 min，超聲功率 231 W，料液比 1 ∶25（g/mL），乙醇的體積分?jǐn)?shù)60%，在此提取條件下，酸木瓜果皮中的總黃酮得率可以達(dá)到（7.31±0.38）%。