曹宗富 劉麗娟 喻浴飛 朱益華 童 繹 馬 旭 陽菊華

1.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所(北京，100081)；2.國家人類遺傳資源中心；3.福建省福州東南眼科醫(yī)院；4.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院；5.福建醫(yī)科大學醫(yī)藥生物工程中心

先天性白內(nèi)障是一組在出生或兒童早期發(fā)生的白內(nèi)障[1]，是一種嚴重的出生缺陷，是世界兒童期可治療性致盲的首要原因[2]。在精準醫(yī)學時代，可以通過基因檢測在植入前、孕期和出生后篩查先天性白內(nèi)障致病突變，實現(xiàn)出生缺陷的三級預防和干預。先天性白內(nèi)障具有明顯的遺傳異質(zhì)性[3]。大量研究證實，先天性白內(nèi)障致病基因包括α/β/γ晶體蛋白基因[4]、膜蛋白基因[5]、調(diào)節(jié)眼球發(fā)育的基因[6]、細胞骨架蛋白基因[7]等基因。本研究對一個常染色體顯性的先天性白內(nèi)障家系的先證者，利用Sanger測序技術(shù)對先天性白內(nèi)障突變熱點區(qū)域進行檢測，對發(fā)現(xiàn)的變異位點在家系中進行驗證，利用美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會(ACMG)的解讀規(guī)則對發(fā)現(xiàn)的變異進行致病性分級。

1 對象與方法

1.1 對象

高頻外顯子測序分析的血液樣本取自福州東南眼科醫(yī)院收治的先天性白內(nèi)障患者及其家屬。每個家庭成員都進行眼部裂隙燈檢查與全身體格檢查，以明確疾病表型與遺傳模式。同時，選取112個正常人群作為陰性對照。每個研究個體均采集5ml靜脈血。

本研究是遺傳性眼病遺傳篩查項目的一部分。相關(guān)的樣本采集及實驗流程均已通過福建醫(yī)科大學倫理審查委員會審查。血樣和臨床資料的收集符合知情同意原則。

1.2 高頻外顯子的選擇

使用計算機文本挖掘和人工檢查相結(jié)合的方法，基于PubMed和CNKI，在基因、外顯子(內(nèi)含子)和變異水平上分別獲得了先天性白內(nèi)障突變譜，發(fā)現(xiàn)突變在各個外顯子上分布是不均勻的，存在突變熱點區(qū)域[8]?；谥袊巳合忍煨园變?nèi)障突變譜，挑選了18個基因的26個外顯子作為突變熱點區(qū)域，對先天性白內(nèi)障家系進行突變篩查[9]。這18個基因包括：CRYAA,CRYAB,CRYBA1,CRYBA4,CRYBB1,CRYBB2,CRYBB3,CRYGC,CRYGD,CRYGS,GJA8,GJA3,HSF4,MIP,BFSP2,EPHA2,FYCO1和PITX3。

1.3 DNA提取和高頻外顯子測序

按照向?qū)Щ蚪MDNA純化工具包 (Promega,中國)的操作說明從全血中提取基因組DNA。對篩選的先天性白內(nèi)障致病基因的26個外顯子及其兩側(cè)的剪接序列進行PCR擴增。GJA8基因的PCR引物和條件見表1。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用雙脫氧末端終止法(Sanger法)進行測序反應，由ABI 全自動DNA測序儀3730XL進行序列分析。首先對先證者進行測序，如果先證者中篩查到可疑突變，然后在其他家系成員和112個正常對照中進行測序驗證。

表1 GJA8基因的PCR擴增引物和條件

1.4 生物信息學分析

篩查到的突變按照HGVS進行命名，用VEP軟件對變異進行注釋，并和dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD以及建立的先天性白內(nèi)障基因變異數(shù)據(jù)庫進行比對。對編碼區(qū)新發(fā)的錯義突變，進一步用PolyPhen2 軟件和SIFT軟件[10]進行功能預測，利用UCSC基因組瀏覽器對突變保守性進行分析。根據(jù)ACMG與美國分子病理協(xié)會(AMP)提出的單基因病變異臨床顯著性的分級標準和指南，對遺傳變異進行致病性分級[11]。首先使用InterVar軟件[12]進行自動化分級然后再行人工校正。遺傳變異的分級包括：致病、可能致病、致病性不明、可能良性、良性。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

該先天性白內(nèi)障家系是由4個成員組成的二代家系，其中包括3個先天性白內(nèi)障患者，先證者為3歲女性。系譜圖(圖1)顯示該先天性白內(nèi)障家系的遺傳模式表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳。該患者表現(xiàn)為左眼正常，右眼晶狀體后囊膜中央?yún)^(qū)皮質(zhì)灰白色混濁，邊緣不整齊，臨床診斷為后極性白內(nèi)障。體格檢查未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)性畸形，患者家屬否認其他眼睛和系統(tǒng)性畸形的家族史，家系內(nèi)其他患者表現(xiàn)為相似的白內(nèi)障表型。

2.2 測序結(jié)果及分析

對該家系先證者的18個基因的26個外顯子進行直接測序，發(fā)現(xiàn)了1號染色體上的GJA8基因的第2號外顯子上569位的一個雜合變異位點(圖2)，由腺嘌呤突變?yōu)轼B嘌呤(c.569A>G)，可導致其編碼的蛋白質(zhì)Cx50在第190位天冬酰胺變成絲氨酸(p.N190S)。該位點在dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD數(shù)據(jù)庫中均未見人群頻率的報道，未收入HGMD數(shù)據(jù)庫和已建立的先天性白內(nèi)障數(shù)據(jù)庫，是罕見的變異位點，SIFT軟件預測為“有害”，PhlyPhen軟件預測為“很可能有害”，保守性分析顯示190位的天冬酰胺在人、猴、小鼠、狗、大象、負鼠、雞、爪蟾以及斑馬魚的GJA8中都非常保守(圖3)。該突變在家系中的對照個體和112個人群對照個體中沒有檢出。在該家系先證者中，其他篩查的17個基因的25個外顯子中沒有發(fā)現(xiàn)突變。該突變在家系患者中符合遺傳共分離規(guī)律。

黑色箭頭為先證者圖1 先天性白內(nèi)障家系圖

黑色箭頭指示變異位點所在的堿基圖2 突變的Sanger測序圖

圖3 GJA8變異位點的保守性分析

2.3 變異的臨床顯著性分級

對發(fā)現(xiàn)的GJA8基因上的變異c.569A>G，根據(jù)ACMG與美國分子病理協(xié)會(AMP)提出的單基因病變異臨床顯著性的分級標準和指南，對遺傳變異進行致病性分級。該研究是基于先天性白內(nèi)障的突變熱點區(qū)域進行測序，變異位點位于突變熱點區(qū)域，因此該位點滿足PM1標準。該變異位點在dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD等公共數(shù)據(jù)庫的對照人群中沒有發(fā)現(xiàn)，因此該變異位點滿足PM2標準。該變異位點在家系中多個先天性白內(nèi)障患者中符合遺傳共分離規(guī)律，因此變異位點滿足PP1標準。Sift、Polyphen2和保守性分析等多種生物信息學方法都預測為有害突變，因此該變異位點滿足PP3標準。其中，InterVar軟件自動判別該位點滿足PM1、PM2和PP3標準，PP1標準為人工校正?；贗nterVar并參考ACMG變異解讀規(guī)則，判斷該變異位點為“可能致病”位點。

根據(jù)以上分析，先證者和同胞弟弟的c.569A>G (p.N190S)位點均來自于父親，符合常染色體顯性遺傳分離規(guī)律(圖1)。該位點在所有已知的數(shù)據(jù)庫中沒有記錄，屬于極罕見的變異。文獻尚沒有報道過，系首次報道。由此判定，GJA8基因的c.569A>G (p.N190S)的雜合變異為該先天性白內(nèi)障家系的可能致病性變異位點。

3 討論

先天性白內(nèi)障存在較強的遺傳異質(zhì)性，文獻報道的相關(guān)基因有30個以上，但前期研究發(fā)現(xiàn)，先天性白內(nèi)障在外顯子水平存在突變熱點區(qū)域[8]。該研究嘗試基于高頻突變外顯子區(qū)域直接測序，并按照ACMG的解讀規(guī)則[12]對變異位點進行解讀，最終在已知的致病基因GJA8中成功篩選到了候選的致病變異位點，c.569A>G (p.N190S)是未經(jīng)報道的新致病變異位點。蛋白質(zhì)保守性分析顯示該氨基酸位點在不同物種間高度保守，提示該位點的氨基酸改變可能對蛋白功能有重要影響。經(jīng)對家系內(nèi)其他成員進行直接測序驗證，表明GJA8的c.569A>G (p.N190S)雜合變異符合遺傳共分離的規(guī)律，為該患者的可能致病性變異位點。

GJA8基因編碼跨膜連接蛋白Cx50，對于晶狀體生長和晶狀體纖維細胞的成熟是必需的[13]。Cx50是晶狀體的連接蛋白，縫隙連接保持離子和水平衡以及晶狀體的透明度和光學性質(zhì)?？p隙連接由2個相互作用的半通道組成，這些半通道在相鄰的細胞之間形成連通通道。每個半通道含有6個連接蛋白亞基。Cx50是縫隙連接通道蛋白的組分之一，并且以鈣和pH依賴性方式發(fā)揮作用[14]。該基因的突變與先天性全白內(nèi)障[15]、核性白內(nèi)障[16]、帶狀核粉性內(nèi)障[17]、后極性白內(nèi)障[18]和白內(nèi)障-小角膜綜合征[19]有關(guān)。GJA8突變可能通過引起Cx50的過表達，從而促使白內(nèi)障的發(fā)生[20]。

該研究再次證明，利用Sanger測序技術(shù)對先天性白內(nèi)障突變熱點區(qū)域進行直接檢測是可行的。該方法與新一代測序技術(shù)相比，成本更低，也更加快速。同時，該方法也具備發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的已報道基因上新變異位點的能力?；谕蛔儫狳c區(qū)域進行直接檢測的方法的一個缺點是，對于未知基因上突變引起的單基因病不能夠檢出。因此，對于高頻外顯子區(qū)域Sanger直接測序方法初篩未檢出病例，應選擇使用新一代測序進行全外顯子組篩查，以進一步提高檢出率。

本文采用高頻外顯子組直接測序技術(shù)，檢測到了先天性白內(nèi)障家系中GJA8基因的一個雜合變異c.569A>G (p.N190S)，此位點是新發(fā)現(xiàn)的變異位點。這一研究結(jié)果不僅拓寬了先天性白內(nèi)障GJA8基因的突變譜，也為將來先天性白內(nèi)障可能進行的產(chǎn)前診斷、孕早期診斷、新生兒出生缺陷早期篩查和預防干預提供了分子基礎(chǔ)。