肖智超,王桂瑛,王雪峰,谷大海,普岳紅,徐志強(qiáng),范江平,葛長榮,廖國周,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

云南省地方家雞資源豐富,鹽津?yàn)豕请u及武定雞都是云南優(yōu)良地方家雞品種的代表。鹽津?yàn)豕请u產(chǎn)于云南省鹽津縣,因生長分布于烏蒙地區(qū)得名“烏蒙珍禽”,它集味美、保健、藥用于一體,體型外貌和生成性能相對穩(wěn)定,屬于藥用肉蛋兼用型品種[1]。武定雞主產(chǎn)于武定、祿勸兩縣,屬肉蛋兼用型品種,具有體型大、產(chǎn)肉多、肉嫩脂豐、皮脆骨酥、味鮮質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、善于覓食等特點(diǎn)[2]。

肉質(zhì)性狀主要受基因和蛋白質(zhì)調(diào)控,運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù),通過對不同動物以及部位的肌肉蛋白質(zhì)進(jìn)行研究分析,可進(jìn)一步探尋肉品質(zhì)與肌肉蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系。近年研究表明,蛋白質(zhì)組與肉的嫩度有很多相關(guān)性。肌肉嫩度主要是由肌纖維相關(guān)組成蛋白、可溶性的肌肉組織和肌節(jié)調(diào)控共同影響的[3]。此外,肌間脂肪含量也會間接影響肉的嫩度[4]。目前,研究者已對鹽津?yàn)豕请u和武定雞理化特性[5-8]、遺傳多樣性[9-10]等方面進(jìn)行分析,而對其肌肉蛋白組鮮有報(bào)道,因此比較這兩種地方家雞品種不同部位蛋白質(zhì)差異,對人們了解家禽生長期間肌肉蛋白質(zhì)變化,探討肌肉生長于肉品品質(zhì)的相關(guān)性具有重要意義。雙向凝膠電泳(Two dimensional electrophoresis,2DE)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)最常用的方法之一[11],將雙向電泳和質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可有效分析肌肉中數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)表達(dá)量。目前,與家禽肉質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還較少,廖國周等[12]對騰沖雪雞的胸肌、腿肌的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)110個(gè)點(diǎn)存在差異表達(dá)。Doherty等[13]發(fā)現(xiàn)蛋雞在不同生長時(shí)期,其雞胸肉中與生長相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)在表達(dá)水平上差異顯著。

本文以鹽津?yàn)豕请u及武定雞為研究對象,分析其腿肌與胸肌中蛋白表達(dá)差異,并對分離的差異蛋白點(diǎn)利用基質(zhì)輔助激光解析電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)進(jìn)行鑒定,對比研究鹽津?yàn)豕请u和武定雞特有蛋白質(zhì),為進(jìn)一步研究地方家雞特征性蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

140日齡鹽津?yàn)豕请u、武定雞母雞各6只(屠宰后分別選取腿肌和胸肌作為樣品,同一部位做三次重復(fù)并置于-80 ℃儲存) 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)種雞場;胎牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)標(biāo)準(zhǔn)品、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、碳酸氫銨 美國Sigma公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸 美國Amresco公司;N,N,N,N-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)、過硫酸銨(ammoniumpersulfate,AP)、碘乙酰胺 美國Amersham公司;胰酶與十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS) 美國Promega公司;固相pH梯度緩沖液(pH4.0～7.0) 美國GE公司;固相pH梯度干膠條(24 cm,pH4.0～7.0) 美國Bio-Rad公司;其它試劑均為分析 純國藥集團(tuán)。

EttanIPGphor III等電聚焦電泳儀 美國GE Healthcare公司;EttanDALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 美國GE Healthcare公司;Powerlook1100凝膠掃描儀 美國Umax公司;Autoflex speedTMMALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 德國Bruker Dalton公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取及純化 取1 g肌肉樣本于研缽中加入液氮研磨成粉后加入10倍體積-20 ℃預(yù)冷的10% TCA/丙酮溶液,置于-20 ℃沉降過夜,在4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min,棄上清液,沉淀物加預(yù)冷丙酮洗滌后,再于4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min,重復(fù)操作2次,沉淀經(jīng)真空干燥后,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)定量 采用Bradford法[5]進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙向電泳

1.2.3.1 等電聚焦 等電聚焦電泳參照IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。肌肉蛋白與水化液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、1% DTT、0.7% IPG(兩性電解質(zhì))緩沖液、0.002%溴酚藍(lán))充分混合后取460 μL上樣。非線性IPG干膠條放入水化液,覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時(shí)尿素析出、蛋白氧化及產(chǎn)生冷凝水,置于EttanIPGphor等電聚焦儀中,重泡脹和等電聚焦均在20 ℃進(jìn)行,每根膠條限流50 μA。

1.2.3.2 膠條平衡 等電聚焦完畢后,膠條先在8 mL平衡緩沖液Ⅰ(pH8.8的0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍(lán)、0.1 mol/L DTT)中平衡15 min,再在8 mL平衡緩沖液Ⅱ(除0.25 mol/L碘乙酰胺替換0.1 mol/L DTT外,其余組分同平衡緩沖液Ⅰ)中平衡15 min。

1.2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至濃度12.5%的凝膠上端,用0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂,待瓊脂糖凝固后即可進(jìn)行第二向SDS凝膠電泳。電泳參數(shù)設(shè)置:2 W/gel,運(yùn)行45 min,然后17 W/gel,直至溴酚藍(lán)指示線跑至膠底緣時(shí)電泳結(jié)束,約4.5 h。IPG膠條的最大電流為50 μA/gel,凝膠厚度為1 mm。

1.2.4 染色與圖像分析 電泳結(jié)束后剝離凝膠,置于考馬斯亮藍(lán)溶液中固定染色2～4 h,換脫色液脫色,直到背景無色透明,蛋白點(diǎn)清晰為止。脫色后的雙向電泳凝膠經(jīng)掃描儀掃描保存圖像,圖像分析采用imageMaster 2D platinum 5.0軟件進(jìn)行。

1.2.5 質(zhì)譜樣品制備 使用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜檢測,激光波長為355 nm,重復(fù)速率為200 Hz,加速電壓為20 kV,最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1500 u。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用imageMaster 2D platinum 5.0軟件對凝膠圖像進(jìn)行分析。當(dāng)兩組樣品間蛋白的相對豐度比>1.5且p<0.05則判斷為差異蛋白點(diǎn)。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析先采用軟件flexAnalysis過濾基線峰、識別信號峰,以BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)并鑒定蛋白質(zhì)種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽津?yàn)豕请u、武定雞肌肉蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜

由圖1～圖4可見,電泳分離較充分,武定雞腿肌肉共發(fā)現(xiàn)(1585±19)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),胸肌肉共發(fā)現(xiàn)(1516±28)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn);鹽津?yàn)豕请u腿肌肉共發(fā)現(xiàn)(1421±34)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),胸肌肉共發(fā)現(xiàn)(1329±25)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過imageMaster 2D platinum軟件分析凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)現(xiàn),鹽津?yàn)豕请u腿肌、胸肌與武定雞腿肌、胸肌的雙向電泳表達(dá)譜基本相似,但是有部分蛋白點(diǎn)的表達(dá)有差異,兩兩進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),鹽津?yàn)豕请u腿肌比其胸肌表達(dá)量高的有55個(gè)蛋白點(diǎn),胸肌比腿肌表達(dá)量高的有54個(gè)蛋白點(diǎn);鹽津?yàn)豕请u腿肌與武定雞腿肌相比較,鹽津?yàn)豕请u比武定雞表達(dá)量高的有28個(gè)蛋白點(diǎn),武定雞比鹽津?yàn)豕请u表達(dá)量高的有59個(gè)蛋白點(diǎn);鹽津?yàn)豕请u胸肌與武定雞胸肌相比較,鹽津?yàn)豕请u比武定雞表達(dá)量高的有44個(gè)蛋白點(diǎn),武定雞比鹽津?yàn)豕请u表達(dá)量高的有47個(gè)蛋白點(diǎn);武定雞腿肌比其胸肌表達(dá)量高的有69個(gè)蛋白點(diǎn),胸肌比腿肌表達(dá)量高的有49個(gè)蛋白點(diǎn)。在鹽津?yàn)豕请u腿肌、胸肌蛋白電泳圖譜上選取11個(gè)差異倍數(shù)大于2倍且達(dá)到顯著水平(p<0.05)的蛋白點(diǎn),如圖1、圖2所示;在武定雞腿肌、胸肌蛋白電泳圖譜上選取13個(gè)差異倍數(shù)大于2倍且達(dá)到顯著水平(p<0.05)的蛋白點(diǎn),如圖3、圖4所示。

圖1 鹽津?yàn)豕请u腿肌雙向電泳圖譜

圖2 鹽津?yàn)豕请u胸肌雙向電泳圖譜

圖3 武定雞腿肌雙向電泳圖譜

圖4 武定雞胸肌雙向電泳圖譜

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索

選取的差異蛋白斑點(diǎn)經(jīng)過酶解之后,以MALDI-TOF/TOFMS分析得到肽段質(zhì)量指紋圖譜,獲得的m/z數(shù)據(jù)送入NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫,通過Mascot搜索引擎檢索,檢索分值在67分以上視為可信結(jié)果(p<0.05)。根據(jù)檢索結(jié)果,鑒定的鹽津?yàn)豕请u、武定雞腿肌和胸肌中差異表達(dá)蛋白的相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。由表1可見,鹽津?yàn)豕请u腿肌和胸肌中分別鑒定出8種和7種蛋白;武定雞腿肌和胸肌中分別鑒定出9種和7種蛋白,鑒定為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反應(yīng)蛋白前體、B鏈α-晶狀體蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌鈣蛋白T、蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞單位14、熱休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假設(shè)蛋白和非特征性蛋白。

表1 鹽津?yàn)豕请u腿肌與胸肌中差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

核纖層蛋白A是細(xì)胞核內(nèi)骨架蛋白,是構(gòu)成核纖層的主要成分,核纖層蛋白A和它的結(jié)合蛋白可以維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和機(jī)械力量,以及參與一些細(xì)胞核內(nèi)活動。如果核纖層蛋白A確實(shí)嚴(yán)重則會影響生物的正常生長發(fā)育,引起肌組織的營養(yǎng)不良和核膜結(jié)構(gòu)的紊亂[14]。磷酸葡萄糖變位酶1(PGM1)是糖原代謝的重要調(diào)節(jié)酶之一[15],許多蛋白都含有PGM1,其對蛋白的磷酸化作用可影響牛肉的嫩度[16]。烯醇酶是糖酵解途徑中的一種重要酶類,其單體主要有α、β和γ型,β-烯醇酶主要存在于心肌和骨骼肌中,也被稱為肌肉特異性烯醇酶[17-18]。以上三種蛋白在鹽津?yàn)豕请u腿肌中含量較高,因此鹽津?yàn)豕请u腿部肌肉擁有更強(qiáng)的運(yùn)動能力。

原肌球蛋白(Tropomyosin,TM),廣泛分布在骨骼肌、心肌和平滑肌以及多種非肌肉細(xì)胞中,其對肌肉收縮起到重要作用[19],脊椎動物中存在4種TM,分別為TPM1、TPM2、TPM3 和 TPM4[20]。其中原肌球蛋白1(TPM1)其在小鼠、雞和鴨胸肌中具有較高表達(dá)量[21-22]。輔酶Q(CoQ)作為線粒體呼吸鏈電子傳遞和質(zhì)子轉(zhuǎn)移的一個(gè)流動性載體,對細(xì)胞線粒體的生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[23]。

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是由肝臟合成的一種典型急性時(shí)相蛋白,當(dāng)機(jī)體患有炎癥或組織損傷等狀況時(shí),血漿中含量極具增加[24]?？赏茢帑}津?yàn)豕请u雞胸肉中CRP含量較高可能是由于胸部肌肉患有炎癥引起的。B鏈α-晶狀體蛋白(CRYAB)屬于熱應(yīng)激家族蛋白,CRYAB可以阻止細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減緩肉成熟速度,增大肌肉剪切力,其表達(dá)量與剪切力呈正相關(guān)[25-26]。超氧化物歧化酶是清除自由基的主要酶之一,它可以催化清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基,從而阻斷自由基的連鎖反應(yīng),保護(hù)機(jī)體免受其害[27]。有研究證明,SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉,其系水力越高、肉色越鮮艷,并且肉質(zhì)越細(xì)嫩[28]。乙二醛酶1是一種以谷胱甘肽作為輔酶,將甲基乙二醛轉(zhuǎn)化為乳酸的酶。原肌球蛋白1的主要作用是加強(qiáng)和穩(wěn)定肌動蛋白絲,抑制肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合。肌酸激CKM(creatine kinase,muscle)是一種肌肉特異型同功酶,是肌肉發(fā)育和分化的標(biāo)志也是骨骼肌能量代謝的關(guān)鍵酶[29]。磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinasePGK)是生物體糖酵解的關(guān)鍵酶,如機(jī)體缺乏磷酸甘油酸激酶則會引起生物體代謝等功能的紊亂[30]。骨骼肌根據(jù)收縮能力可分為快肌和慢肌兩種類型[31],肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)肌肉收縮的關(guān)鍵蛋白,包括肌鈣蛋白T、I和C[32]。熱休克蛋白β-1(HspB1)具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化、抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激耐受等作用[33]。此外,本試驗(yàn)中還鑒定出一些未分類的假設(shè)蛋白和非特征性蛋白,這些蛋白質(zhì)的功能以及蛋白質(zhì)之間的相互作用,還有待做更進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用DE技術(shù)分離了云南鹽津?yàn)豕请u和武定雞腿肌與胸肌中蛋白質(zhì),并以MALDI-TOF/TOF MS鑒定出其中的差異蛋白質(zhì)點(diǎn),得出以下結(jié)論:

利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù),發(fā)現(xiàn)在鹽津?yàn)豕请u與武定雞肌肉中存在178個(gè)明顯表達(dá)差異的蛋白點(diǎn),其中在鹽津?yàn)豕请u中蛋白明顯上調(diào)的有72個(gè),在武定雞中蛋白明顯上調(diào)的有106個(gè)。

據(jù)差異蛋白分析結(jié)果,篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和規(guī)律性變化差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,經(jīng)過Mascot搜索引擎檢索后成功鑒定出31個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反應(yīng)蛋白前體、B鏈α-晶狀體蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌鈣蛋白T、蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞單位14、熱休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假設(shè)蛋白和非特征性蛋白。