腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤之一，根據(jù)美國腦腫瘤注冊中心統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)瘤約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27%，彌漫性星形細(xì)胞瘤發(fā)病率為 0.53/10萬，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病率最高，占46.1%，約為3.20/10萬[1]。高級別膠質(zhì)瘤因其位置特殊，浸潤生長快、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，盡管不斷地改進(jìn)手術(shù)方法與放化療方案，但中位生存期僅約14.6個月[2]，治療效果并不理想，亟須新的治療方案。研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在功能性的淋巴系統(tǒng)，且可被調(diào)控[3]，打破傳統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)為“免疫豁免區(qū)”的觀念，也為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來新的診療思路。越來越多的研究證明，免疫檢查點(diǎn)及共刺激分子在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。近年來，程序性死亡因子1(PD-1)及程序性死亡因子配體1(PD-L1)的研究備受關(guān)注。PD-1/PD-L1屬于負(fù)性共刺激分子，其對T淋巴細(xì)胞有抑制和促凋亡的作用[5]。研究證明，PD-L1高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1可使腫瘤細(xì)胞避開機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視產(chǎn)生免疫逃逸[6]。PD-1/PD-L1阻斷治療已運(yùn)用于多種腫瘤中，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等，臨床試驗(yàn)效果令人欣慰，但仍存在諸多問題[7]。因此，研究PD-1/PD-L1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、免疫逃逸的機(jī)制及其在PD-1/PD-L1阻斷治療中的運(yùn)用有著重要意義。 有研究表明，PD-L1的表達(dá)受到腫瘤微環(huán)境的影響，而缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factors-1α，HIF-1α)在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控方面起到了重要作用[8]。本研究探討不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中PD-L1和HIF-1α的表達(dá)情況及其之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤免疫治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及標(biāo)本來源 選取2012年6月—2017年6月在山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本43份，涉及病人43例，男23例，女20例；年齡32～65歲，平均53歲；均為初發(fā)病人，既往體健，無基礎(chǔ)疾病史，未做過放、化療，臨床資料完整。按照2007年世界衛(wèi)生組織(WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對43份腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行分組，其中Ⅰ級8份，Ⅱ級11份，Ⅲ級11份，Ⅳ級13份，Ⅰ級、Ⅱ級為低級別組，Ⅲ級、Ⅳ級為高級別組。所有樣本的收集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過并獲得病人及其家屬知情同意。

1.2 主要試劑 小鼠抗人PD-L1單克隆抗體、增強(qiáng)型染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司，兔抗人HIF-1α單克隆抗體購自上海雅吉生物技術(shù)有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、枸櫞酸緩沖液及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 免疫組織化學(xué)染色法按試劑說明書進(jìn)行，將手術(shù)切除的腫瘤組織做成石蠟標(biāo)本后，切4 μm厚度薄片，置于65 ℃烤片機(jī)中烘烤1 h，脫蠟水化，用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中高壓水煮修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，滴加一抗(1∶400稀釋)置于4 ℃冰箱孵育過夜，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，添加二抗，PBS緩沖液沖洗3次， DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫色，干燥，中性樹脂封片。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)陽性細(xì)胞在組織細(xì)胞中所占比例以及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按顯色細(xì)胞數(shù)記分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<25%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)25%～49% 為2分，陽性細(xì)胞數(shù)≥50%為3分；按細(xì)胞顯色深淺記分，無陽性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)積分相乘，0為(-)，1～2為(+)，3～4 為(++)，6～9 為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析對PD-L1和 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況及臨床病理特征關(guān)系

2.1.1 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況 腦膠質(zhì)瘤組織中，顯微鏡下觀察HIF-1α陽性為黃褐色，染色位于細(xì)胞核。43份腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)陽性率為58.14%(25/43)。詳見圖1、圖2。

圖1 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中陰性表達(dá)(×400)

圖2 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)(×400)

2.1.2 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 43份腦膠質(zhì)瘤組織中，HIF-1α在低級別組(Ⅰ級～Ⅱ級)中的表達(dá)陽性率為36.84%(7/19)，在高級別組(Ⅲ級～Ⅳ級)中的表達(dá)陽性率為75.00%(18/24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.2 PD-L1在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況及臨床病理特征關(guān)系

2.2.1 PD-L1在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況 腦膠質(zhì)瘤組織中，顯微鏡下觀察PD-L1陽性為棕黃色，染色位于細(xì)胞質(zhì)。43份膠質(zhì)瘤組標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)陽性率為69.77%(30/43)。詳見圖3、圖4。

圖3 PD-L1在腦膠質(zhì)瘤中陰性表達(dá)(×400)

圖4 PD-L1在腦膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)(×400)

2.2.2 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 43例腦膠質(zhì)瘤組織中，PD-L1在低級別組(Ⅰ級～Ⅱ級)中的表達(dá)陽性率為52.63%(10/19)，在高級別組(Ⅲ級～Ⅳ級)中的表達(dá)陽性率為83.33%(20/24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤組織PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中 HIF-1α、PD-L1 表達(dá)的相關(guān)性 在 HIF-1α 表達(dá)陽性的25例腦膠質(zhì)瘤組織中，有22例PD-L1表達(dá)陽性；在HIF-1α 表達(dá)陰性的18例腦膠質(zhì)瘤組織中，有10例 PD-L1 表達(dá)陰性。Spearman 相關(guān)分析顯示，HIF-1α表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.002 1)。詳見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤組織中 HIF-1α、PD-L1 表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤具有高侵襲性和破壞性，并且預(yù)后差，盡管不斷地改進(jìn)手術(shù)方法與放化療方案，但高級別膠質(zhì)瘤病人的平均生存率仍然很低[9]。腫瘤免疫治療越來越成為研究的重點(diǎn)，也為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了新的思路。研究表明，膠質(zhì)瘤與其微環(huán)境相互作用產(chǎn)生局部和系統(tǒng)性免疫抑制的能力[10]。因此，在手術(shù)治療、放療、化療等綜合治療后，探討中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步了解免疫治療成為目前腦膠質(zhì)瘤治療的新思路與新挑戰(zhàn)。

所有有核細(xì)胞都具有感知和響應(yīng)氧濃度變化的能力，對缺氧的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)主要由缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)介導(dǎo)，其由3個亞基(HIF-1α，HIF-2α或HIF-3α)和1個HIF-1b亞基組成。在這3種亞基中，HIF-1α表達(dá)最為普遍，并且在許多細(xì)胞類型中作為氧穩(wěn)態(tài)的調(diào)控亞基起關(guān)鍵作用[11]。腫瘤的特征是腫瘤細(xì)胞的過度生長從而導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量的增加，造成瘤體內(nèi)缺氧環(huán)境的形成。而腫瘤的缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)HIF-1α等細(xì)胞因子釋放，體現(xiàn)為在腫瘤中表達(dá)增加。Slemc等[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞氧濃度降低時，HIF-1α蛋白水平呈指數(shù)增加。近年來研究表明，HIF-1α除了參與促進(jìn)膠質(zhì)瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、腫瘤細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡及增殖外，在腫瘤細(xì)胞免疫調(diào)控方面也有至關(guān)重要的作用[13]。Kumar等[14]研究表明，HIF-1α過度表達(dá)可促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的免疫抑制活性以及MDSC向TAM的快速分化，從而影響機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

PD-L1為PD-1的主要配體，CD編號為CD274，廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)、活化的T細(xì)胞、活化的B細(xì)胞等免疫細(xì)胞。PD-L1/PD-1可啟動抑制性信號從而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答，屬于負(fù)性共刺激分子[15]。在多種人類腫瘤組織中如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等可檢測到PD-L1的表達(dá)，并且較正常組織PD-L1表達(dá)水平高[16-17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1是HIF-1α的作用靶點(diǎn)，缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞或腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)上調(diào)可能是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的關(guān)鍵點(diǎn)[6，8]。Koh等[18]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織在缺氧環(huán)境下，HIF-1α協(xié)同STAT3可快速、顯著增強(qiáng)EML4-ALK轉(zhuǎn)位的pADC細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)。此外，EML4-ALK通過增加轉(zhuǎn)錄和減少HIF-1α的泛素化來增強(qiáng)HIF-1α表達(dá)。Pinato等[19]在小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的組織中研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下檢測到PD-L1的高表達(dá)且與腫瘤中HIF-1α的比例成正比。

本實(shí)驗(yàn)通過對不同級別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的HIF-1α及PD-L1進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，HIF-1α及PD-L1的表達(dá)陽性程度均顯著上升，且兩者表達(dá)存在正相關(guān)性。提示在缺氧微環(huán)境下，HIF-1α參與調(diào)控PD-L1的表達(dá)。當(dāng)前腦膠質(zhì)瘤中PD-L1與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性尚無更深入的研究報(bào)道，PD-L1的調(diào)控機(jī)制及其在腦膠質(zhì)瘤中的療效值得進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤組織中，HIF-1α和PD-L1蛋白明顯共表達(dá)，揭示了腦膠質(zhì)瘤中腫瘤缺氧微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的一種重要機(jī)制，進(jìn)一步了解PD-1/PD-L1參與腫瘤免疫逃逸的機(jī)制可以為腦膠質(zhì)瘤診斷及治療提供新的思路。