陸 璐，陶雅軍，羅學婭，馬君燕*

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

果聚糖是β-D-呋喃果糖的多聚體，是由蔗糖與一個或多個果糖分子連接而成的水溶性或黏性的高分子多糖。果聚糖存在于某些被子植物（約15%）、細菌和少數(shù)真菌中，具有多種生理功能和生物活性。在植物中，除了作為碳水化合物的儲備庫，果聚糖還可以通過穩(wěn)定細胞膜來提高植物耐寒和抗旱的能力[1]。在人體內(nèi)，果聚糖選擇性促進雙歧桿菌和乳酸菌等腸道有益細菌的生長，促進鈣、鎂元素的吸收，抑制齲齒和結(jié)腸癌的產(chǎn)生[2-3]。因此，果聚糖常被添加到功能食品和飼料中。

糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）第32家族負責果聚糖糖苷鍵的水解或合成，包括菊粉酶、蔗糖酶、果聚糖酶等水解酶類和果糖基轉(zhuǎn)移酶類。此家族有共同的三維結(jié)構(gòu)特征：N-端5-折疊β-螺旋漿形成的催化結(jié)構(gòu)域和C-端β-折疊片形成的類似三明治的非催化結(jié)構(gòu)域[4]。目前對于GH32家族N-端催化結(jié)構(gòu)域的研究比較深入，對C-端非催化結(jié)構(gòu)域的功能認知較少，但發(fā)現(xiàn)其在底物結(jié)合[5-6]和調(diào)節(jié)底物特異性[7]方面發(fā)揮重要作用。

有關(guān)GH32家族結(jié)構(gòu)的研究可以追溯到20世紀90年代，早期的研究主要是通過定點突變和化學修飾來確定酶的催化活性中心[8-9]，隨后對保守區(qū)域氨基酸所起的作用進行了研究[10-11]，同時研究了活性位點周圍氨基酸和loop環(huán)在酶活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、底物特異性等方面所起的作用[12-13]。研究人員發(fā)現(xiàn)圍繞在活性位點周圍、連接催化結(jié)構(gòu)域中不同元件的loop環(huán)和轉(zhuǎn)角決定酶的特異性[4，14]。近年來，分子對接、分子動力學模擬在研究酶與底物的結(jié)合及酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮越來越重要的作用[15-16]。目前，GH32家族已有15種酶的晶體結(jié)構(gòu)得到解析。晶體結(jié)構(gòu)的解析可以確定酶的催化活性中心、酶與底物的結(jié)合位點，闡明酶的催化機制和底物特異性，從而明確酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，為酶蛋白的分子改造提供理論依據(jù)。

本文綜述了GH32家族的成員及功能、三維結(jié)構(gòu)、催化活性中心和催化機制，論述了芳香族氨基酸在酶與底物識別中所起的重要作用，以期為GH32家族的結(jié)構(gòu)研究及分子改造提供參考。

1 GH32家族的成員及應用

GH32家族主要來自植物、真菌和細菌，包括兩大類：一是對含果糖的糖類物質(zhì)進行水解的酶類，如酸性蔗糖酶、菊粉酶、果聚糖酶、植物果聚糖外切水解酶（fructan exohy drolases，F(xiàn)EHs）；二是具有果糖轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)果糖苷酶類，主要是果聚糖生物合成酶類（fructan biosynthetic enzymes，F(xiàn)BEs），如蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶。

蔗糖酶催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，其水解產(chǎn)物是原核生物和真核生物主要的碳能源儲備，而且是植物信號通路的重要組成部分，具有感應植物營養(yǎng)狀況的作用。因此蔗糖酶在碳分配、控制植物細胞分化和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。根據(jù)最適pH值，蔗糖酶可以分為酸性和中性/堿性蔗糖酶，兩類蔗糖酶的序列和生化特性都有很大不同[4]。酸性蔗糖酶存在于液泡或細胞壁中，屬于GH32家族。

菊粉酶是一類能水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶，根據(jù)作用底物方式的不同，分為外切菊粉酶和內(nèi)切菊粉酶。外切菊粉酶是菊芋生物煉制中的關(guān)鍵酶，其能將菊芋一步水解，獲得高純度的果糖漿，生產(chǎn)燃料乙醇、生物柴油、微生物油脂等工業(yè)產(chǎn)品，廣泛應用在食品、醫(yī)藥及生物能源等領(lǐng)域[5]。內(nèi)切菊粉酶可以用來生產(chǎn)低聚果糖，聚合度為2～7的低聚果糖是一種功能性多糖，有多種生理功能，如改善腸道內(nèi)微生物區(qū)系，使腸道菌群中雙歧桿菌等有益菌數(shù)量增加。

植物FEHs用水分子作為果糖基的受體，從果聚糖供體末端釋放果糖分子，由FEHs完成的快速的果聚糖降解，被認為是植物果聚糖動員必不可少的過程[6]。與微生物外切菊粉酶和果聚糖酶通常水解蔗糖不同，目前所有植物FEHs都不能降解蔗糖。

FBEs催化果糖單元到蔗糖分子上，負責果寡糖/果聚糖的合成[2]。

2 GH32家族的結(jié)構(gòu)

GH32家族由N-端5-折疊β-螺旋漿形成的催化結(jié)構(gòu)域和C-端β-折疊片形成的非催化結(jié)構(gòu)域組成。N-端每個螺旋漿包括4個反向平行的β-折疊片，形成經(jīng)典的‘W’拓撲結(jié)構(gòu)，輻射狀圍繞著中心軸，封閉帶負電荷的催化活性口袋[17]。每個β-折疊片之間由發(fā)卡環(huán)連接，β-折疊片4與下一個螺旋漿的β-折疊片1相連。每個螺旋漿的β-折疊片1離中心軸最近，并與中心軸平行。整個N-端結(jié)構(gòu)域的形狀類似圓柱形，每個螺旋漿β-折疊片4位于圓柱筒的最外面[17]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ATCC 14580來源的6-磷酸蔗糖酶通過亞單位N末端β-折疊片區(qū)域的相互作用形成穩(wěn)定瘦長型同源二聚體[18]。5-折疊β-螺旋漿的晶體結(jié)構(gòu)相對于（β/α）8折疊桶狀結(jié)構(gòu)比較少見，主要存在于GH32、GH43、GH62和GH68家族[19]，其中GH32和GH68家族歸屬于GH-J氏族（clan）。GH32家族的結(jié)構(gòu)模式如下[6]：

C-端非催化結(jié)構(gòu)域由2個反向平行的β-折疊片組成，每個β-折疊片包括6股β-折疊線，組裝成類似三明治的結(jié)構(gòu)，與凝集素或類凝集素蛋白結(jié)構(gòu)類似。研究發(fā)現(xiàn)，酵母來源的多聚體蔗糖酶C-端非催化結(jié)構(gòu)域也具有結(jié)合底物、調(diào)節(jié)底物特異性的作用[6-7]。許旺酵母β-呋喃果糖苷酶二聚體的C-端結(jié)構(gòu)域，通過與另一亞基活性位點復雜的相互作用，參與底物結(jié)合并調(diào)節(jié)底物特異性[7]。同時發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌外切果聚糖酶的C-端β-三明治結(jié)構(gòu)域?qū)儆诙嗵墙Y(jié)合模塊（carbohydratebindingmodule，CBM）66家族[20]，CBM具有識別底物、結(jié)合底物、使催化結(jié)構(gòu)域接近底物等作用[21-22]，從而增大底物附近酶的濃度，以此來提高酶的活性。正是CBM 66與果三糖特異性結(jié)合，賦予酶具有底物特異性[20]。N-端和C-端之間由短的多肽鏈相連，兩者之間形成狹長的裂縫，此裂縫可能具有識別長鏈高聚合度果聚糖底物的作用[23]，多個氫鍵和疏水作用維持這兩個結(jié)構(gòu)域處于穩(wěn)定的位置。

GH32家族第一個晶體結(jié)構(gòu)來自海棲熱孢菌（Thermotogamaritima）蔗糖酶，晶體分辨為2?，揭示了GH32家族的三維結(jié)構(gòu)分為兩個結(jié)構(gòu)域：5-折疊β-螺旋漿結(jié)構(gòu)域和β-三明治結(jié)構(gòu)域[24]。此酶底物廣泛，不僅可以水解蔗糖，還能水解棉子糖、蔗果四糖和菊粉。無花果曲霉（Aspergillus ficuum）內(nèi)切菊粉酶晶體結(jié)構(gòu)的解析，揭示了酶具有特異性的內(nèi)切活性在于圍繞著催化活性位點由兩個loop環(huán)和保守序列WM（I）NDEPG形成的額外口袋[25]。植物中，GH32家族第一個被報道的3D結(jié)構(gòu)是菊苣（Cichorium intybus）來源的果聚糖外切水解酶1-FEH IIa[26]。FEHs在植物中擔負著水解果糖的任務(wù)，它可能來自有缺陷的蔗糖酶，Asp239位的單突變使擬南芥細胞壁蔗糖酶1（Arabidopsisthalian cell wall invertase1，Atcw INV 1）具有了1-FEH的活性[23]。GH32家族蔗糖酶中首先得到晶體解析的是Atcw INV1[27-28]，它只能水解蔗糖，不能水解菊粉。與其他GH32家族不同的是，Atcw INV1的晶體結(jié)構(gòu)顯示，N-端與C-端之間的狹長裂縫內(nèi)存在較長的糖鏈，糖鏈會阻止菊粉與酶的結(jié)合。因此，推測這個裂縫內(nèi)存在菊粉結(jié)合位點[26]。節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）果聚糖轉(zhuǎn)移酶（fructosyl transferase，F(xiàn)Tase）催化果聚糖形成環(huán)形二果糖苷，三維結(jié)構(gòu)顯示其分子基礎(chǔ)是活性位點loop環(huán)區(qū)的序列保守（主要是側(cè)鏈分子量小的氨基酸），能形成獨特的催化活性口袋，即在-1和-2位點容納環(huán)形二果糖苷，而其他GH32家族因loop環(huán)序列的改變不存在-2位點[29]。紅發(fā)夫酵母（Xanthophyllomycesdendrorhous）β-呋喃果糖苷酶（XdINV）的晶體結(jié)構(gòu)解析，首次揭示了N-糖基化修飾參與酶的聚合、調(diào)節(jié)酶的活性[4]。而白曲霉（Aspergillus kawachii）來源的β-呋喃果糖苷酶（fructofuranosidase，F(xiàn)Fase）與果糖底物的晶體結(jié)構(gòu)闡明了此酶具有高活性轉(zhuǎn)果糖基作用的原因，主要是二聚體白曲霉Fase的聚合狀態(tài)與其他GH32家族酶不同，果糖能同時與-1和+1亞位點結(jié)合，+1位點的果糖與Ile146和Glu296通過氫鍵相互作用[16]。擬南芥細胞壁蔗糖酶1的三維結(jié)構(gòu)模式如下[28]：

3 GH32家族的催化機制

糖苷水解酶對底物糖苷鍵的水解是通過一般的酸堿催化反應來完成的，需要2個氨基酸殘基參與：質(zhì)子供體和親核試劑，水解反應發(fā)生在-1和+1位點之間[30]。根據(jù)底物的異頭碳構(gòu)象水解時是否發(fā)生發(fā)轉(zhuǎn)，糖苷水解酶的水解反應機制分為兩種：保持型和反轉(zhuǎn)型。無論是哪種機制，糖苷水解酶的質(zhì)子供體與糖苷鍵氧原子的距離在氫鍵范圍內(nèi)。在保持型酶中，親核試劑/堿緊鄰糖分子的異頭碳原子，平均距離大約為4.5～5.5?。然而在反轉(zhuǎn)型酶中，親核試劑與糖分子的異頭碳原子之間必須容納一個水分子，通常平均距離為9.0～9.5 ?[31]。

糖苷水解酶家族的結(jié)構(gòu)并不直接決定酶的催化機制，很多超家族中同時具有保持型和反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶。但分屬同一家族的水解酶往往具有相同的催化機制。GH32家族的成員屬于保持型糖苷水解酶，在進行催化反應時會保留異頭碳的構(gòu)象，通過雙取代機制，形成酶-底物中間過渡態(tài)來完成水解反應[8]。Atcw INV1的反應機制如圖1所示。親核試劑和酸/堿催化劑分別為D23和E203，經(jīng)兩步反應，蔗糖被水解成果糖和葡萄糖（水為受體）[32]。第一步反應是親核試劑D23的羧基對底物果糖基的異頭碳進行親核攻擊，形成糖-酶共價中間體。酸/堿催化劑E203作為一般的質(zhì)子供體提供質(zhì)子給離去基團葡萄糖殘基。第二步反應是酸/堿催化劑E203作為廣義堿，中和果糖基受體上的質(zhì)子（蔗糖酶中水為受體），從而水解糖-酶中間體。

圖1 擬南芥細胞壁蔗糖酶1的雙取代保留反應模式[30]Fig.1 Double displacement retaining mechanism of sucrase 1 from Arabidopsis thaliana cellwall

4 GH32家族的催化活性中心

GH32家族有3個高度保守的氨基酸，位于催化活性口袋的內(nèi)部，準確地說，它們是位于色氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸保守區(qū)域中的3個酸性氨基酸，2個天冬氨酸（Asp）（D）和1個谷氨酸（Glu）（E），被稱為“催化三聯(lián)體”，負責結(jié)合和催化底物，為GH32家族的催化活性中心[10，16，30]。日本曲霉（Aspergillusjaponicus）CB05果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性中心見圖2，D60/D191/E292為該酶的“催化三聯(lián)體”[2]。WMNDPNG序列中的Asp為親核試劑，ECP序列中的Glu擔任的是酸/堿催化劑，在催化反應中提供質(zhì)子，RDP序列中的Asp并不直接參與催化作用，通過H鍵與果糖分子C3和C4位的羥基相連，在結(jié)合底物和穩(wěn)定底物-酶轉(zhuǎn)換過渡態(tài)中發(fā)揮重要的作用[30-31]。通過對泡盛曲霉（Aspergillusawamori）外切菊粉酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB：1Y4W）的解析，NAGEM R A等[17]研究發(fā)現(xiàn)Asp41和Glu241分別為其親核試劑和酸/堿催化劑。為了闡明RDP保守序列中Asp189在催化反應中的作用，他們將Asp189進行定點突變，得到Asp189Asn的突變體。晶體結(jié)構(gòu)解析表明，Asp189Asn突變并未對催化活性位點氨基酸殘基的位置產(chǎn)生較大影響，但使Asp41和Asn189之間可能會形成野生酶中并不存在的H鍵，這樣的H鍵相互作用將會改變Asp41的親核性，引起Asp41側(cè)鏈羥基的電子云密度向Asn189的咪唑基團轉(zhuǎn)移，從而使Asp41的親核性變?nèi)?，影響酶水解蔗糖的效率，但不影響酶的特異性，這為Asp189具有結(jié)合和穩(wěn)定底物的作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[18]。

圖2 菌株CB05果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性中心[2]Fig.2 Catalytic activity center of fructosyltransferase of strain CB05

5 GH32家族中的芳香族區(qū)域

酶與糖類底物相互作用時，除了極性基團參與酶對底物的識別，一些非極性C-H基團也可以發(fā)揮與眾不同的作用，如芳香族氨基酸借助于芳香環(huán)與糖分子之間的范德華力和CH-π堆積力發(fā)揮穩(wěn)定糖-酶復合物的作用[23，33]。GH32家族中，在酶催化活性位點周圍存在一個主要由色氨酸（Trp）（W）和苯丙氨酸（Phe）（F）組成的芳香族區(qū)域，分別位于WMNDPN、WGN和WSGSAT序列中，這個疏水性保守區(qū)域?qū)τ诰S持底物與酶的結(jié)合具有非常重要的作用。如圖3所示，Trp19/Phe46/Trp82組成1-FEH IIa的芳香族區(qū)域[23，30]。在GH32家族菊粉酶和蔗糖酶中，第一個序列中的芳香族氨基酸是Trp，然而在FBEs中常以Phe或酪氨酸（Tyr）（Y）代替Trp[34]。在菊粉酶中，第三個序列中的芳香族氨基酸是Phe[25]。Atcw INV1中Trp的單突變使酶對蔗糖表現(xiàn)出米氏常數(shù)（Km）值增加，尤其是W 47L突變體的Km值增加了600倍，原因在于W 47最接近催化活性位點，野生酶W 47的芳香環(huán)以優(yōu)勢構(gòu)象與底物相互作用，由于Trp的突變，使得酶與底物的結(jié)合不穩(wěn)定[23]。竹子液泡蔗糖酶和菊苣1-FEH IIa中Trp47的類似物分別為Trp159和Phe46[11，23]。

值得關(guān)注的是，芳香族區(qū)域氨基酸殘基的構(gòu)象受周圍氨基酸的影響，使底物以抑制劑型或底物型兩種不同的構(gòu)象與酶的活性中心結(jié)合，改變酶活力。菊苣1-FEH IIa中的絲氨酸（Ser）101會影響Trp 82的構(gòu)象，將Ser101突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）后，1-FEH IIa的底物蔗糖從抑制劑構(gòu)象變?yōu)椴环€(wěn)定的底物構(gòu)象，從而使1-FEH IIa具有了蔗糖酶活性[35]。1-FEH IIa中抑制劑型蔗糖構(gòu)象與Atcw INV1中底物型蔗糖的構(gòu)象明顯不同，雖然兩者在-1位點的果糖殘基構(gòu)象非常相似，但+1位點葡萄糖殘基的構(gòu)象明顯不同（見圖4）[35]。Trp82在1-FEH IIa中呈現(xiàn)了與Atcw INV1中Trp82不同的構(gòu)象。定點突變的研究表明，菊苣1-FEH IIa Trp82的構(gòu)象受其周圍Ser101殘基的影響，使蔗糖以抑制劑型的構(gòu)象與活性位點結(jié)合[36]。然而，當許多FEHs中Ser101位被疏水性氨基酸殘基（亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸）（Leu/Ile/Val）取代時，101位氨基酸與Trp82類似物產(chǎn)生堆積力，進而阻止蔗糖以抑制劑型構(gòu)象與催化活性位點結(jié)合，這樣FEHs具有了水解蔗糖的能力。相反，當101位是小分子甘氨酸（Gly）或Ser時，導致Trp82構(gòu)象改變，蔗糖以抑制劑型構(gòu)象與催化活性位點結(jié)合，F(xiàn)EHs水解蔗糖的能力被蔗糖強烈抑制[34]。這說明，Trp82的構(gòu)象決定著蔗糖以抑制型還是底物型與FEHs活性位點結(jié)合。

圖3 菊苣1-FEH IIa的芳香族區(qū)域[23]Fig.3 Aromatic zone of chicory 1-FEH IIa

圖4 蔗糖作為1-FEH IIa的抑制劑在活性位點的構(gòu)象（A）以及蔗糖作為Atcw INV1的底物在活性位點的構(gòu)象（B）[35]Fig.4 Conformation of sucrose as an inhibitor of 1-FEH IIa(A)or a substrate of Atcw INV1(B)in the active sites

6 展望

近年來，針對GH32家族，科研人員從微生物菌株篩選、誘變改造、酶學性質(zhì)、克隆表達及同步糖化發(fā)酵等方面進行了較多的研究，并初步開始解析其結(jié)構(gòu)和功能基團，然而，現(xiàn)有酶在活力和穩(wěn)定性方面仍較難達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。伴隨分子生物學的發(fā)展，20世紀80年代興起的對現(xiàn)有的天然蛋白質(zhì)進行改造的蛋白分子改造工程是解決這一問題的有效措施。氨基酸序列比對、同源模擬和晶體結(jié)構(gòu)的解析等研究方法，有助于闡明酶與底物的結(jié)合位點、酶具有底物特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，加深我們對酶結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合和催化機理的認知，為酶分子的改造提供理論基礎(chǔ)。尤其是酶與底物晶體結(jié)構(gòu)的解析，能揭示酶具有特異性的分子基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上進行改造，可以實現(xiàn)酶的“量身定制”，將現(xiàn)有的酶分子改造成適合工業(yè)生產(chǎn)、具有商業(yè)應用價值的工具酶，豐富現(xiàn)有的酶庫。