付海鵬，李鐸，郭志坤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng) 453003）

心包包括纖維性心包和漿膜性心包。纖維結(jié)締組織構(gòu)成外層的纖維性心包的主要成分，漿膜性心包一部分覆蓋于心肌外面,形成心外膜，另一部分緊貼于纖維性心包的內(nèi)面。將心包中的脂肪組織消化之后培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中表達(dá)CD44和CD90，但是不表達(dá)CD34以及CD45[1,2]。CD44和CD90是干細(xì)胞的標(biāo)記之一，CD44和CD90陽性細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[3]。用心包液作為培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可使這些細(xì)胞分化為表達(dá)CD106和CD90的細(xì)胞[4]。有人證明，大鼠心包膜組織存在內(nèi)皮生長因子受體KDR陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞[5]。這些研究結(jié)果提示，心包組織中可能存在分化潛能的干細(xì)胞。由于這些細(xì)胞與心肌組織關(guān)系密切，其中是否存在已知心肌干細(xì)胞（C-kit、Scal-1、Nanog等陽性細(xì)胞），目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)大鼠心包組織中是否存在C-kit、Scal-1、Nanog陽性細(xì)胞，為進(jìn)一步利用心包組織治療心肌損傷提供更多的細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 取材和切片

6周齡SD大鼠50只，體重100～150g，雌雄不分，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SYKY（豫）2010-0002] 。所有大鼠頸椎脫臼法處死，沿膈肌與肋緣交界處打開胸腔，暴露心臟，剪取全部心包，其中30只大鼠心包經(jīng)過4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片和組織鋪片（每例心包各取一半用于鋪片），切片厚8μm。分別進(jìn)行HE和Masson染色，中性樹膠封片。另外10只心包用4%多聚甲醛固定24h后，30%蔗糖溶液脫水12h，OTC包埋，恒冷冰凍切片機(jī)冰凍切片，片厚8μm，免疫組織化學(xué)染色。其余10只用于Western blotting。

2 SP法免疫組織化學(xué)染色

取冰凍切片放入恒溫烤箱內(nèi)烤片15min，置于保濕盒內(nèi)，滴加3%過氧化氫10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗3×3min。滴加一抗小鼠抗大鼠C-kit多克隆抗體（Santa公司），小鼠抗大鼠Nanog單克隆抗體（Santa公司），兔抗大鼠Sca-1多克隆抗體（Millibo公司），濃度分別為1：500、1：600和1:800] 4℃過夜。PBS浸洗，3min×3，滴加山羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），室溫下孵育20min；PBS浸洗，3min×3；DAB染色1min；流水沖洗5min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡觀察照相。

3 免疫熒光雙標(biāo)染色

取冰凍切片室溫下解凍，置于保濕盒內(nèi)；微波爐內(nèi)用枸櫞酸鹽溶液行抗原修復(fù)5min；滴加0.1%Triton X-100透膜30min，PBS浸洗3min×3；10%山羊血清封閉1h，加入一抗（分別抗C-kit、Sca-1、Nanog），4℃冰箱12h；PBS浸洗3min×3，洗去一抗；根據(jù)一抗種屬來源不同加入相應(yīng)的FITC或Cy3標(biāo)記的二抗（1:500，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），室溫下孵育2h，PBS浸洗3min×3；DAPI染核5min，PBS浸洗3min×3后在玻片上滴加抗熒光衰減封片劑、封片，熒光顯微鏡或者激光共聚焦掃描顯微鏡觀察照相。

結(jié) 果

1 大鼠心包的組織結(jié)構(gòu)

切片和鋪片經(jīng)HE和Masson染色均顯示，大鼠心包含有大量纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，豐富的膠原纖維（粗束）和彈性纖維（細(xì)束）交織成網(wǎng)（圖1B、D）。在成纖維細(xì)胞之間和血管周圍，存在大量散在的小而圓（或橢圓）細(xì)胞。這些圓細(xì)胞核相對(duì)較小，細(xì)胞質(zhì)豐富（圖1）。在鋪片標(biāo)本上可清晰地看到粗細(xì)不等的血管走行，血管分布、吻合和結(jié)構(gòu)完整（圖1B、D）。

2 大鼠心包含有C-kit、Sca-1、Nanog陽性細(xì)胞

免疫組織化學(xué)SP法染色顯示，大鼠心包組織中存在豐富的C-kit、Sca-1、Nanog陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞在形態(tài)和分布與切片和鋪片上觀察到的小圓細(xì)胞一致。細(xì)胞形態(tài)均為相對(duì)較小，圓形或橢圓形，細(xì)胞核較小，大多細(xì)胞核內(nèi)存在異染色質(zhì)，偶見細(xì)胞分裂。這些細(xì)胞多單個(gè)存在，偶爾聚集成群，廣泛分布于成纖維細(xì)胞之間和小血管周圍；其胞質(zhì)豐富，陽性產(chǎn)物呈顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖2）。在心包的不同部位，C-kit、Sca-1、Nanog陽性細(xì)胞分布的疏密差異較大，但無規(guī)律性。

3 C-kit、Sca-1、Nanog在大鼠心包內(nèi)共表達(dá)

用Cy3標(biāo)記C-kit、Nanog，F(xiàn)ITC標(biāo)記Sca-1和C-kit進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，心包組織存在表達(dá)C-kit、Sca-1、Nanog陽性細(xì)胞。且部分細(xì)胞同時(shí)共表達(dá)C-kit和Scal-1抗原（圖3A），幾乎全部細(xì)胞同時(shí)共Sca-1和Nanog抗原（圖3B），然而，C-kit與Nanog抗原則共表達(dá)于血管彈力膜上（圖3C）。在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管外膜的部分細(xì)胞只有Nanog單獨(dú)表達(dá)（圖3C）。

討 論

心包是包裹心臟和大血管根部的纖維性漿膜囊，從發(fā)生學(xué)上來看，心包和心臟是同一來源，因此，從理論上講，心包中也應(yīng)該存在心肌組織的某些細(xì)胞成分。已有研究表明，心外膜中含有能分化為心肌細(xì)胞和血管平滑肌潛能的心臟干細(xì)胞[6,7]。目前較為肯定的心肌干細(xì)胞包括C-kit、Nanog、Sca-1、Isl-1等陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞廣泛分布于心肌細(xì)胞之間，具有成骨、成脂和成心肌的分化潛能[8]，但這些細(xì)胞是否也存在于纖維性心包組織中，目前知之甚少。

圖1 大鼠心包的組織結(jié)構(gòu)。HE（A、B、C）和Masson（D）染色；A、B和D為鋪片，C為切片；比例尺，50μmFig. 1 Tissue structure of rat pericardium. HE (A, B, C) and Masson (D) staining； A，B and D were prepared by surface spread technique, C was prepared by paraffin section technique； scale bar, 50μm

圖2 大鼠心包組織中C-kit（A）、Sca-1（B）、Nanog（C和B）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。比例尺：A、B和D=50μm，C=25μmFig. 2 C-kit (A), Sca-1 (B) and Nanog (C and B) immunoreactive cells in rat pericardium. Scale bar: A, B and D=50μm，C=25μm

2010年Limana等，將心肌梗死患者的心包液注射進(jìn)正常小鼠的心包腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)心包膜發(fā)生了增殖,且HGF等促干細(xì)胞分化因子的表達(dá)都要高于對(duì)照組[9]。黃立功等[3]用心包液作為培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，心包液能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化，使其表達(dá)CD106和CD90。Beltrami等利用心包液修復(fù)小鼠受損心肌發(fā)現(xiàn)，被治療心肌和血管上有富含microRNA的心包液外泌體，這些外泌體能夠促進(jìn)內(nèi)皮的增殖，恢復(fù)缺血后血流的恢復(fù)以及血管的重建[10,11]。以上研究提示，心包液中存在與心肌組織再生、修復(fù)和干細(xì)胞有關(guān)的物質(zhì)。因此，推測(cè)心包組織尤其是纖維心包和漿膜性心包的壁層中，也可能存在干細(xì)胞成分。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)大鼠心包內(nèi)C-kit、Sca-1和Nanog共表達(dá)。比例尺，50μmFig. 3 Coexpression of C-kit, Sca-1 and Nanog in rat pericardium examined by immunofluorescence double-labeling staining. Scale bar, 50μm

2012年王曉明等從心包外脂肪組織中分離出血管內(nèi)皮生長因子激酶插入域受體陽性細(xì)胞（kinase insert domain receptor, KDR），并誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞[5]。嚴(yán)格意義上講，這項(xiàng)研究的組織標(biāo)本，既不是纖維心包，也不是漿膜心包，屬于脂肪組織來源的干細(xì)胞，但它提示心包的臨近組織存在干細(xì)胞成分。我們的研究采用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，證明大鼠纖維心包組織中同時(shí)存在C-kit、Sca-1、Nanog陽性細(xì)胞，而且這些細(xì)胞也均存在于心肌組織中。心包中的干細(xì)胞在形態(tài)特征，干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)等方面與心肌組織干細(xì)胞完全相同[12-14]，說明心包來源的干細(xì)胞與心肌組織來源的干細(xì)胞有相同的生物學(xué)特性。然而這些干細(xì)胞群在心肌分化及其在心肌修復(fù)中的作用尚需進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，表達(dá)某一標(biāo)記物細(xì)胞，即定義為一類細(xì)胞或細(xì)胞亞群。本研究對(duì)C-kit和Scal-1、Nanog和scal-1、Nanog和C-kit分別進(jìn)行了共表達(dá)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一種陽性細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)另一種表面標(biāo)記，可見僅從一種表面標(biāo)記對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類并不準(zhǔn)確。干細(xì)胞的蛋白表達(dá)及其生物學(xué)行為可能在很多方面存在交叉和重疊，這就增加了對(duì)干細(xì)胞亞群分類和功能判定的復(fù)雜性。

由于大鼠心包菲薄透明，所取心包組織總是折疊，采用一般組織切片，鏡下觀察到的組織成分雜亂無序，各組織成分之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系遭到破壞，很難對(duì)各種成分進(jìn)行定位。故本研究采用鋪片技術(shù)，能夠清晰地顯示組織成分的全貌，以及各結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，尤其是血管與細(xì)胞之間的位置關(guān)系。鋪片技術(shù)不僅用于一般組織學(xué)觀察，也適用于大鼠心包的免疫組織化學(xué)染色。