張紅醫(yī), 陳 躍, 馬紅玉, 李美婷, 何怡帆, 周 燦

(河北大學(xué) a. 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院； b. 化學(xué)教學(xué)研究所；c. 化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 河北 保定 071002)

0 引 言

就目前常用的分離檢測(cè)技術(shù)而言，毛細(xì)管電泳或離子色譜主要使用水基緩沖液，因此被認(rèn)為是綠色分離技術(shù)[1]。根據(jù)Welch等[2]的測(cè)算，一臺(tái)配備了傳統(tǒng)尺寸色譜柱的傳統(tǒng)液相色譜儀器每天至少產(chǎn)生1 L的廢液，并且這些廢液中往往包含了較高含量的影響健康和環(huán)境安全的有機(jī)溶劑。據(jù)文獻(xiàn)估計(jì),世界上有13萬(wàn)臺(tái)液相色譜儀正在使用[3]，那么每年將產(chǎn)生3 400萬(wàn)L化學(xué)廢液。

為了響應(yīng)綠色化學(xué)的要求，圍繞著減少液相色譜廢液的產(chǎn)生、降低廢液的處理費(fèi)用，近年來(lái)綠色液相色譜分析法的研究日益得到重視。綠色液相色譜的一個(gè)突出的做法就是使用小內(nèi)徑，如UPLC(內(nèi)徑2.1 mm或1 mm)的柱子代替內(nèi)徑4.6 mm的傳統(tǒng)液相色譜柱HPLC[4]。超高效液相色譜(UHPLC)不僅采用了更小內(nèi)徑的柱子，而且采用了更短的柱子，顯著降低了分析時(shí)間，進(jìn)而大大降低了分析過(guò)程中溶劑的消耗和廢液的產(chǎn)生[5-6]。綠色液相色譜的另一個(gè)做法就是從液相色譜的流動(dòng)相入手，例如：用乙醇代替乙腈做流動(dòng)相[7-8]、過(guò)熱水色譜(Superheated Water Chromatography)[9-10]、離子液體作為流動(dòng)相改性劑或流動(dòng)相[11-12]。

盡管如此，綠色液相色譜實(shí)驗(yàn)在本科生儀器分析實(shí)驗(yàn)課程及其實(shí)驗(yàn)教材中還沒(méi)有得到應(yīng)有的重視[13-14]。在我校自編的實(shí)驗(yàn)教材中，也只有一個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及到了超高效液相色譜法[14]。本文在文獻(xiàn)[15]的基礎(chǔ)上，形成了一個(gè)適合本科生實(shí)驗(yàn)的綠液相色譜方法。該方法采用間接紫外檢測(cè)法對(duì)溶液中甲醇、乙醇含量進(jìn)行了測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)的開(kāi)設(shè)會(huì)帶來(lái)如下三方面的好處。① 激勵(lì)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。從方法上講，該實(shí)驗(yàn)采用反相液相色譜間接檢測(cè)法，其有別于目前常見(jiàn)的直接紫外檢測(cè)法，會(huì)使學(xué)生有耳目一新的感覺(jué)。從檢測(cè)對(duì)象來(lái)看，樣品是生活中常見(jiàn)的酒品或生物燃料，會(huì)使學(xué)生感到一種親近感。② 學(xué)會(huì)并掌握一種評(píng)價(jià)液相色譜流動(dòng)相的環(huán)境評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Environmental Assessment Tool, EAT)[16]的小程序，為其今后從文獻(xiàn)中選擇和評(píng)價(jià)液相色譜方法提供了一個(gè)新視角和新工具。③ 更重要的是該實(shí)驗(yàn)向?qū)W生們直接傳遞了可持續(xù)發(fā)展、綠色化學(xué)(Green chemistry)、綠色分析化學(xué)(Green Analytical Chemistry, GAC)[17]和綠色液相色譜法(Green reversed phase high performance liquid chromatography)[18]等先進(jìn)的理念，以及化學(xué)工作者在推進(jìn)綠色化學(xué)研究和應(yīng)用中所應(yīng)擔(dān)負(fù)的社會(huì)責(zé)任。通過(guò)深入挖掘該實(shí)驗(yàn)中的“綠色、生態(tài)、環(huán)保”等與社會(huì)主義核心價(jià)值觀相關(guān)的思想政治元素，在一定程度上起到了“課程思政”的育人作用[19]。

1 原理和實(shí)驗(yàn)

1.1 原理和程序

(1) 間接檢測(cè)的基本原理[20]。間接光度液相色譜檢測(cè)法一般是在流動(dòng)相體系中加入一種在檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有較高吸收系數(shù)的試劑(稱(chēng)為紫外洗脫試劑)，以形成高的紫外吸收本底。當(dāng)樣品引入到色譜柱內(nèi)后，無(wú)紫外吸收的待測(cè)組分與紫外洗脫試劑發(fā)生相互作用或者在色譜柱上產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)保留，由于基流的變化而導(dǎo)致吸收信號(hào)的變化，產(chǎn)生組分色譜峰。間接光度檢測(cè)時(shí)既會(huì)出現(xiàn)正方向色譜峰也會(huì)出現(xiàn)負(fù)方向色譜峰，一般符合表1所示的規(guī)律。

表1 間接光度法中的正負(fù)峰規(guī)律

(2) 液相色譜流動(dòng)相環(huán)境評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)原理和計(jì)算程序。Koller等[21]采用從不同數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的數(shù)據(jù)，充分考慮了物質(zhì)的物理、化學(xué)、環(huán)境和安全性質(zhì)計(jì)算出了安全因子S、健康因子H和環(huán)境因子E。在計(jì)算方法中，通過(guò)規(guī)定可替代的數(shù)據(jù)源，有效地解決了因物理、化學(xué)、或者毒性數(shù)據(jù)缺失所產(chǎn)生的制約因素。S,H和E數(shù)據(jù)可用于高度刻畫(huà)和區(qū)分不同溶劑和化學(xué)品。

基于13種最常用的液相色譜有機(jī)溶劑，Gaber等[16]創(chuàng)立了一種簡(jiǎn)單工具(HPLC-EAT)，該方法可以以計(jì)算得分的辦法來(lái)識(shí)別所選HPLC方法的綠色性。HPLC-EAT 法可以計(jì)算從等度洗脫到三元梯度等不同運(yùn)行模式下的不同流動(dòng)相的HPLC-EAT指標(biāo)量。當(dāng)純水流動(dòng)相或含有改性劑(或者鹽緩沖液)的水溶液做流動(dòng)相時(shí)，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的重要作用，因而將它們的S、H和E設(shè)為零

HPLC-EAT=S1m1+H1m1+E1m1+S2m2+

H2m2+E2m2+ … +Snmn+

Hnmn+Enmn

式中：S、H和E分別是Koller等所用的安全因子、健康因子和環(huán)境因子；n代表溶劑數(shù)目;m代表溶劑質(zhì)量。HPLC-EAT計(jì)算程序和使用手冊(cè)可以從下面網(wǎng)頁(yè)的右側(cè)區(qū)域免費(fèi)下載：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2011/GC/c0gc00667j#!。divAbstract該程序的運(yùn)行需要在Java環(huán)境下。

1.2 儀器與試劑

(1) 儀器。LC-20AD型高效液相色譜儀(島津，日本)，配有Diamonsil反相C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm，Dikma)、SPD-20A紫外/可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器(島津，日本)、CBM-10A型在線工作站(島津，日本)，7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥(美國(guó))及AT-330型色譜柱恒溫箱；SKCH-10S超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；SZ-93自動(dòng)蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠)。

(2) 試劑。甲醇、丙酮均為色譜級(jí)試劑，乙醇為分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為雙蒸水，實(shí)驗(yàn)樣品為白酒和烹飪用生物燃料等。測(cè)試樣品溶液和流動(dòng)相使用前要經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 樣品溶液制備。醇基燃料：量取一定體積的樣品，并定量轉(zhuǎn)移到蒸餾瓶中進(jìn)行水浴蒸餾，接收80 ℃以?xún)?nèi)的餾分。餾分直接進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積5 μL。白酒：過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積5 μL。

(2) 反相液相色譜條件的設(shè)定。流動(dòng)相：丙酮/水(4 / 96)，流速：0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：233 nm，進(jìn)樣體積：5 μL，柱溫30 ℃。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。配制系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(乙醇：1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%，甲醇：1%、3%、5%、10%、20%)進(jìn)行反相高效液相色譜測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，通過(guò)Origin繪制工作曲線，得到線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)等數(shù)據(jù)。

(4) 實(shí)際樣品的測(cè)定。在相同的儀器條件下，測(cè)定樣品溶液。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

丙酮具有明顯的紫外吸收，它在流動(dòng)相中所占的比例對(duì)間接光度檢測(cè)中起著決定性的作用。當(dāng)以10%(體積百分?jǐn)?shù))的甲醇為樣品，進(jìn)樣體積保持5 μL不變的條件下，對(duì)流動(dòng)相中丙酮的百分含量進(jìn)行研究。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)丙酮含量較低時(shí)(2%)時(shí)，甲醇的峰面積也較低；當(dāng)丙酮含量在3%～4%時(shí)，甲醇的峰面積達(dá)到最大；當(dāng)丙酮含量高于4%后，甲醇的峰面積開(kāi)始明顯下降。因此，選擇4%丙酮作為最優(yōu)流動(dòng)相。

圖1 甲醇峰面積隨流動(dòng)相中丙酮百分含量的變化

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

在丙酮與水體積比為4%的流動(dòng)相條件下，考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)甲醇的峰面積的影響。由圖2可見(jiàn)，隨著檢測(cè)波長(zhǎng)220～233 nm逐漸增大，甲醇的峰面積也逐漸增大。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)在233 nm 和236 nm時(shí)，甲醇的峰面積基本保持不變。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)在236～250 nm范圍內(nèi)依次變大時(shí)，對(duì)應(yīng)的甲醇峰面積卻逐漸降低。因此，選擇233 nm 作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 甲醇峰面積隨檢測(cè)波長(zhǎng)的變化

2.3 典型色譜圖與樣品分析

在最佳的色譜條件為：以丙酮/水(4/96，體積分?jǐn)?shù))為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為233 nm，進(jìn)樣體積為5 μL，色譜柱溫度為30 ℃，將不同濃度的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液注射到色譜柱內(nèi)進(jìn)行色譜分析。甲醇和乙醇混合溶液的典型色譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，每個(gè)色譜圖都有3個(gè)色譜峰，其中1#峰為甲醇峰，2#峰為乙醇峰，3#峰為系統(tǒng)峰。由于甲醇和乙醇以及作為紫外洗脫試劑使用的丙酮都不帶電荷，且1#甲醇峰的保留時(shí)間短于3#系統(tǒng)峰的保留時(shí)間，2#乙醇峰的保留時(shí)間長(zhǎng)于3#系統(tǒng)峰的保留時(shí)間，所以，甲醇應(yīng)為正峰，乙醇應(yīng)為負(fù)峰。系統(tǒng)峰有時(shí)為正峰，有時(shí)為負(fù)峰，但該峰的保留時(shí)間均在2.78 min。當(dāng)只注射甲醇水溶液時(shí)，甲醇峰為正峰，而此時(shí)的系統(tǒng)峰為負(fù)峰。隨著甲醇的濃度依次增大，甲醇峰將隨之增大，而系統(tǒng)峰也將向著負(fù)峰方向逐漸增大。當(dāng)只注射乙醇水溶液時(shí)，乙醇峰為負(fù)峰，而此時(shí)系統(tǒng)峰為正峰還是負(fù)峰，會(huì)受乙醇濃度的影響。當(dāng)乙醇濃度小于1%時(shí)，系統(tǒng)峰為負(fù)峰；而當(dāng)乙醇濃度高于1%時(shí)，系統(tǒng)峰為正峰[22]。

在最佳條件下，分別制作甲醇和乙醇的工作曲線。甲醇(正峰)和乙醇(負(fù)峰)的工作曲線分別為：

其中Y為峰面積，X為體積百分?jǐn)?shù)。將取自某飯店的醇基燃料經(jīng)蒸餾處理后，測(cè)得其蒸餾后乙醇含量為23.26%，甲醇的含量為4.90%。實(shí)驗(yàn)測(cè)得某品牌白酒為36%，其標(biāo)示量為38%。圖4為經(jīng)處理后的含醇燃料的色譜圖。

(a) 1% methanol + 2% ethanol

(b) 2% methanol + 1% ethanol

(c) 10% methanol + 20% ethanol

(d) 20% methanol + 10% ethanol

1—methanol； 2—ethanol； 3—system peak.

圖3 不同甲醇和乙醇濃度所對(duì)應(yīng)的液相色譜圖

圖4 經(jīng)蒸餾處理后的生物燃料的典型色譜圖

2.4 液相色譜流動(dòng)相環(huán)境評(píng)價(jià)(EAT)的計(jì)算

通過(guò)Web of Science檢索發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)[23]是HPLC測(cè)定甲醇的最經(jīng)典方法。該方法在HPLC分析前需要對(duì)甲醇進(jìn)行衍生化處理，所用的流動(dòng)相為正己烷-二氯甲烷 (9∶1)。用HPLC-EAT程序分別對(duì)本文所介紹的液相色譜流動(dòng)相以及文獻(xiàn)[23]的流動(dòng)相進(jìn)行EAT評(píng)價(jià)。由圖5可見(jiàn)新方法的總EAT得分小于0.017 5，而文獻(xiàn)[23]所對(duì)應(yīng)的總EAT得分大于25。顯而易見(jiàn)，從綠色化學(xué)的角度來(lái)看，本文所推薦的液相色譜法顯著優(yōu)于文獻(xiàn)[23],而且本文的方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)甲醇和乙醇的測(cè)定。

(a) HPLC Environment Assessment Chart

(b) HPLC Environment Assessment Chart

3 結(jié) 語(yǔ)

本文推薦了一個(gè)可用于甲醇和乙醇同時(shí)檢測(cè)的綠色液相色譜分析法實(shí)驗(yàn)，該方法用4%的丙酮水溶液作為流動(dòng)相。該流動(dòng)相的EAT得分值小于0.017 5，其綠色指數(shù)顯著優(yōu)于測(cè)定甲醇的經(jīng)典HPLC方法[23](EAT得分25)。它起到了對(duì)目前儀器分析實(shí)驗(yàn)中綠色色譜實(shí)驗(yàn)匱乏的一點(diǎn)彌補(bǔ)作用。從實(shí)驗(yàn)時(shí)間來(lái)看，該方法實(shí)驗(yàn)消耗少，分析時(shí)間短，可在4 min內(nèi)完成，十分適合做本科生的實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容看，間接光度檢測(cè)豐富了學(xué)生對(duì)檢測(cè)方法的全面理解，初步了解液相色譜中系統(tǒng)峰的概念。從實(shí)驗(yàn)的推廣和實(shí)用性來(lái)看，可以讓學(xué)生掌握HPLC-EAT程序的使用，掌握對(duì)液相色譜方法進(jìn)行評(píng)價(jià)的一個(gè)新的指標(biāo)，掌握一種測(cè)定白酒類(lèi)和生物燃料中甲醇和乙醇的一種新方法。