血管內(nèi)皮細(xì)胞活化是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)患者早期重要的病理生理改變[1-2]，活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種炎性因子、血管活性物質(zhì)以及大量的氧自由基，促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展[3]。CD40/CD40配體(CD40L)分布于內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，可通過(guò)多種信號(hào)通路活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其過(guò)表達(dá)黏附分子、炎性因子以及氧自由基等，與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。白細(xì)胞介素(IL)-35是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等分泌的新型抗炎因子，可以抑制脂多糖(LPS)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)[5]，但尚不明確IL-35是否可抑制sCD40L對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化。本研究檢測(cè)冠心病患者外周血清中可溶性CD40配體(sCD40L)和IL-35的水平，并分析IL-35對(duì)sCD40L活化血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用，探討IL-35在冠心病發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018年2月至2018年8月在江蘇省濱?？h人民醫(yī)院心內(nèi)科診斷的冠心病患者43例，其中不穩(wěn)定型心絞痛患者20例(UA組)，急性ST段抬高型心肌梗死患者23例(STEMI組)，所有患者行冠狀動(dòng)脈造影檢查，診斷和分型均符合《心臟病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；同時(shí)選取年齡、性別匹配的20例健康體檢者作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾病、瓣膜性心臟病、擴(kuò)張型心肌病、腦卒中、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤以及使用類(lèi)固醇類(lèi)藥物的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)01/2018)，所有參加者簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑

細(xì)胞因子IL-35購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；sCD40L購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；sCD40L、IL-35、E-選擇素、可溶性細(xì)胞間黏附因子(sICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、氧自由基(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 血液標(biāo)本采集

AMI患者在入院時(shí)采集外周靜脈血3 mL，其余患者在入院次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，置于肝素鈉抗凝管，3 000 r/min離心2 min，收集血清，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的培養(yǎng)

取剖宮產(chǎn)孕婦分娩的健康新生兒臍帶20 cm，采用胰酶消化法獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞，將其接種于含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)后，選取第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記CD31，純度達(dá)85%以上。實(shí)驗(yàn)分為空白組、sCD40L組和IL-35+sCD40L組。sCD40L組加入25 μg/mLs CD40L，IL-35+sCD40L組加入20 ng/mL IL-35和25 μg/mL sCD40L，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，上清液儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA法檢測(cè)外周血清中IL-35、sCD40L水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中E-選擇素、sICAM-1水平

使用ELISA試劑盒檢測(cè)外周血清中IL-35、sCD40L水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1的水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 比色法檢測(cè)HUVEC中MDA水平及SOD活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)方法及分組同1.4，培養(yǎng)后棄上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HUVEC的MDA水平及SOD活性。

1.7 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針?lè)z測(cè)HUVEC中ROS活性

將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板，初始密度為4×105/孔，培養(yǎng)方法及分組同1.4，每孔加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)液以及20 μmol/L DCFH-DA溶液，混勻，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min后用培養(yǎng)液輕輕洗滌細(xì)胞2次，熒光顯微鏡觀察拍照(激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)，ImageJ軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度值(IOD)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用student′st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；偏態(tài)分布采用中位數(shù)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；線性相關(guān)分析采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血清IL-35和sCD40L水平比較

3組患者年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。ELISA試劑盒檢測(cè)外周血清IL-35及sCD40L的水平。與對(duì)照組相比，UA組、AMI組IL-35水平均降低，且STEMI組降低更為顯著；而sCD40L水平顯著升高，且STEMI組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 3組患者臨床資料比較

表2 3組患者外周血清IL-35和sCD40L水平比較

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與UA組比較，(2)P<0.05

2.2 冠心病患者外周血清IL-35與sCD40L的相關(guān)性分析

冠心病患者外周血清IL-35水平與sCD40L水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.443，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.3 IL-35對(duì)HUVEC分泌E-選擇素、sICAM-1的干預(yù)作用

ELISA法檢測(cè)3組HUVEC培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1的水平。與空白組相比，sCD40L組E-選擇素、sICAM-1水平均顯著增加(P均<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組E-選擇素、sICAM-1水平均顯著降低(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 3組HUVEC培養(yǎng)上清中E-選擇素、sICAM-1水平比較

注：與空白組比較，(1)P<0.05；與sCD40L組比較，(2)P<0.05

2.4 IL-35對(duì)HUVEC中MDA水平及SOD活性的影響

比色法檢測(cè)3組HUVEC中MDA水平及SOD活性。與空白組相比，sCD40L組HUVEC中MDA水平顯著升高，SOD活性顯著下降(P均<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組HUVEC中MDA水平顯著下降，SOD活性顯著升高(P均<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 3組HUVEC中MDA水平及SOD活性比較

注：與空白組比較，(1)P<0.05；與sCD40L組比較，(2)P<0.05

2.5 IL-35對(duì)HUVEC中ROS活性的影響

DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)3組HUVEC中ROS活性。與空白組相比，sCD40L組HUVEC中ROS活性顯著升高(13.45±4.12對(duì)3.65±2.08，P<0.05)；與sCD40L組相比，IL-35+sCD40L組HUVEC中 ROS活性顯著降低(7.09±3.06對(duì)3.65±2.08，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：A為空白組；B為sCD40L組；C為IL-35+sCD40L組

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞活化在冠心病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有阻止巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞形成、調(diào)節(jié)凝血和阻止血栓形成的功能?；罨难軆?nèi)皮細(xì)胞可分泌多種生物活性物質(zhì)如E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子和ROS等，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[3]，慢性炎性反應(yīng)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的主要因素，并貫穿于整個(gè)冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。炎性反應(yīng)的激活以及促炎/抗炎因子的失衡與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、斑塊的破裂、血栓的形成等密切相關(guān)，促進(jìn)了穩(wěn)定型心絞痛向UA，加劇了疾病進(jìn)展[8]。

CD40/CD40L的相互作用可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，影響免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等信號(hào)通路，與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[9]。CD40L與CD40相互作用促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、E-選擇素等的表達(dá)，增加氧自由基的生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[10]；同時(shí)，CD40通過(guò)與CD40L的相互作用調(diào)控多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的破裂[11]。sCD40L是CD40L水解形成的具有生物活性的可溶性片段，與CD40L具有相同的生物學(xué)功能[12]。Yuan等[4]研究表明，循環(huán)血液中sCD40L能刺激泡沫細(xì)胞的形成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，增加粥樣斑塊的不穩(wěn)定性，加速冠心病的發(fā)展。Heeschen等[13]研究表明，sCD40L對(duì)冠心病具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。Fouad等[14]研究發(fā)現(xiàn)，UA及急性心肌梗死患者外周血清sCD40L水平顯著高于穩(wěn)定型心絞痛及健康體檢者。本研究結(jié)果與上述研究一致，顯示STEMI患者與UA患者外周血清sCD40L水平顯著升高，且STEMI患者升高更顯著。

IL-35是IL-12家族的新成員，由兩個(gè)亞基組成，其主要生物學(xué)功能是：(1)抑制血管炎性反應(yīng)；(2)促進(jìn)Treg細(xì)胞活化，增強(qiáng)其抑制功能；(3)抑制輔助T細(xì)胞(Th)1、Th17等細(xì)胞的增殖；(4)促進(jìn)抗炎因子如IL-10的產(chǎn)生，抑制促炎因子如IL-17的產(chǎn)生[15]。本研究表明，冠心病患者外周血IL-35水平顯著降低，且STEMI患者降低更為顯著，這與Lin等[16]研究結(jié)果一致。Mor 等[17]研究表明，冠心病患者外周血Treg比例下降，其抑制功能也明顯下調(diào)。IL-35可能通過(guò)加重炎性反應(yīng)參與冠心病的發(fā)生。

本研究顯示IL-35與sCD40L水平呈負(fù)相關(guān)，IL-35能顯著抑制sCD40L誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素、sICAM-1的分泌。E-選擇素和ICAM-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化后分泌大量的E-選擇素和ICAM-1，兩者通過(guò)與細(xì)胞間受體結(jié)合，促進(jìn)白細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞緊密黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，影響動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性[18]，促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展。

MDA和SOD可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化、受自由基攻擊的損傷程度和機(jī)體清除氧自由基的能力。在生理狀態(tài)下，氧自由基生成和清除維持平衡狀態(tài)；在病理狀態(tài)下，這一平衡被打破，細(xì)胞受損或活化，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究顯示，IL-35明顯降低血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物水平，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞清除氧自由基的能力，從而抑制sCD40L對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血IL-35水平顯著降低，而sCD40L水平顯著升高，兩者呈負(fù)相關(guān)。IL-35能抑制sCD40L誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，其機(jī)制主要通過(guò)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)氧化及血管內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的水平，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞清除氧自由基的能力。結(jié)果表明，IL-35和sCD40L在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，調(diào)控IL-35和sCD40L可能是治療冠心病的新途徑。