勾曉梅，李雪麗，隋 源，周麗霞

0引言

煙曲霉菌是一種致病性較強的病原菌，數(shù)據(jù)顯示，因煙曲霉菌感染導(dǎo)致角膜炎癥發(fā)生的研究增多[1]。近年來我國患煙曲霉菌性角膜炎的人數(shù)也在逐年增加，嚴(yán)重制約人們的生活水平，影響人們的身心健康[2]。大黃素主要從大黃中提取出來，是大黃的主要有效成分[3]。大黃素藥理性質(zhì)廣泛，具有抑菌消炎、保肝利尿的功效，同時還可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[4]。本實驗通過大黃素對煙曲霉菌性角膜炎模型大鼠進(jìn)行治療，研究其抗炎作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料選取30只雄性健康清潔級SD大鼠，體質(zhì)量215～255(平均225.5±10.2)g，鼠齡9～12(平均10.5±0.3)mo，均符合動物保護(hù)條例。由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，大鼠飼養(yǎng)嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作，環(huán)境溫度保持于22℃～25℃，濕度45%～55%，每小時通風(fēng)6～10次，每天按時給水及添加飼料，每2d更換墊料1次。煙曲霉菌菌種由中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心提供。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑和儀器：大黃素(廣東中山康之源生物有限公司提供)；流式細(xì)胞儀、Western blot試劑盒(天津九鼎公司)；PPAR、MAPK、NF-κB一抗和二抗(英國Abcam公司提供)。

組別數(shù)量(只)角膜炎癥指數(shù)(分)角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)(個/視野)正常組103.15±0.5540.25±10.16模型組86.25±1.55a90.12±17.25a大黃素組84.31±0.35a,c59.45±13.36a,c F8.87111.494P<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs模型組。

1.2方法

1.2.1煙曲霉菌性角膜炎模型建立將菌種在Sabouroud培養(yǎng)基中接種，在25℃環(huán)境下培養(yǎng)1wk，采用滅菌水配置真菌孢子懸濁液，將孢子濃度調(diào)整為1×108CFU/mL。選取20只大鼠制備煙曲霉菌性角膜炎模型。參考任毅等[5]模型建立并適當(dāng)進(jìn)行改正，在制備前使用5g/L左氧氟沙星滴眼液滴注雙眼，4次/d，連續(xù)滴注3d。之后采用3.5mL/kg 10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，采用1%鹽酸丁卡因滴注大鼠雙眼，常規(guī)消毒后，采用4mm環(huán)鉆在角膜中間進(jìn)行定位，將角膜上皮清除后，覆蓋直徑6mm的軟性角膜接觸鏡，將濃度為1×108CFU/mL的懸濁液注入鏡片與角膜層之間，在結(jié)膜囊位置涂抹氧氟沙星眼膏，之后采用5-0絲線將上下眼瞼縫合。手術(shù)9h后拆線，將軟性角膜接觸鏡移除。建模48h后，發(fā)現(xiàn)大鼠角膜白潤病癥深度加深，范圍擴(kuò)大，覆蓋整個眼球，說明建模成功。

1.2.3角膜炎癥指數(shù)統(tǒng)計角膜炎癥指數(shù)評分以病灶大小、病變深度為標(biāo)準(zhǔn)。病灶大?。翰≡钫冀悄た偯娣e的1%～25%，記為1分；病灶占角膜總面積的>25%～50%，記為2分；病灶占角膜總面積>50%～75%，記為3分；病灶占角膜總面積的>75%～100%，記為4分。病變深度：角膜顯示輕度混濁，但瞳孔和虹膜清晰，記為1分；角膜淺層顯示灰白色混濁，瞳孔和虹膜通過病灶可以觀察到，記為2分；角膜全層不透明，顯示不均勻的混濁，記為3分；角膜顯示均勻致密混濁，記為4分。

1.2.4病理學(xué)觀察提取大鼠角膜組織，在10%甲醛緩沖液中保持48h，之后脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理后，采用HE進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察大鼠角膜病理學(xué)特征，并對角膜炎癥細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附測定法TNF-α、IL-6、ICAM-1指標(biāo)檢測采用50mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20μg/mL，在96孔酶標(biāo)板中加入100μL/孔，4℃過夜保存。第2d舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入150μL 1% BSA，在37℃環(huán)境中封閉1h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100μL不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2h。采用PBST洗滌5次，加入100μL稀釋后的HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育1h。PBST洗滌5次，之后使用顯色劑顯色20min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

1.2.6 Western blot檢測PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)將采集到的標(biāo)本使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35min，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。取20μg/孔蛋白質(zhì)，通過10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15min；100V電泳10min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5h；與一抗(稀釋濃度1∶10000)結(jié)合，加入TBST稀釋按1∶1000稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃環(huán)境下孵育過夜保存；第2d用TBST緩沖液清洗，與二抗(稀釋濃度1∶10000)結(jié)合在室溫下孵育1h，再次用TBST緩沖液反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其僅在底物溶液中進(jìn)行顯色，分析其灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達(dá)量，分析PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1三組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)比較如表1所示，三組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2三組大鼠角膜組織病理學(xué)觀察正常組大鼠角膜組織上皮表現(xiàn)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠角膜組織膠原纖維發(fā)生腫脹，排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤，壞死組織脫落，形成潰瘍。大黃素組大鼠角膜組織炎性細(xì)胞減少，膠原纖維排列整齊(圖1)。

2.3三組大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平比較三組大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組TNF-α、IL-6、ICAM-1水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組TNF-α、IL-6、ICAM-1水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.4三組大鼠PPAR、MAPK、NF-κB的蛋白表達(dá)比較三組大鼠PPAR、MAPK、NF-κB的蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠PPAR蛋白表達(dá)低于正常組，MAPK、NF-κB蛋白高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組PPAR蛋白表達(dá)高于模型組，MAPK、NF-κB低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大黃素組PPAR蛋白表達(dá)低于正常組，MAPK、NF-κB表達(dá)高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3，圖2)。

圖1三組大鼠角膜組織病理學(xué)觀察(HE)A：正常組(×200)；B：模型組(×400)；C：大黃素組(×200)。

組別數(shù)量(只)TNF-αIL-6ICAM-1正常組10353.15±20.55140.25±11.1638.66±5.45模型組8468.25±50.55a290.12±20.25a68.42±10.33a大黃素組8382.11±10.85a,c189.45±15.36a,c45.36±8.62a,c F9.88630.00711.820P<0.01<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs模型組。

組別數(shù)量(只)PPARMAPKNF-κB正常組101.15±0.060.32±0.050.42±0.03模型組80.25±0.05a1.25±0.08a1.36±0.05a大黃素組80.88±0.04a,c0.95±0.03a,c1.06±0.02a,c F50.96342.92679.157P<0.01<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs模型組。

3討論

真菌性角膜炎致病菌是真菌，是一種感染性角膜病。真菌性角膜炎與長時間配戴角膜接觸鏡和使用抗生素有關(guān)[7]。我國主要的致病真菌主要有鐮刀菌屬、曲霉菌屬和念珠菌等[8]。煙曲霉菌屬于曲霉菌屬，煙曲霉菌角膜炎使用一般的抗菌藥物治療，很難完全殺死，增大了治療難度，嚴(yán)重時會導(dǎo)致角膜潰瘍、角膜穿孔甚至失明[9]。本研究中，建立煙曲霉菌性角膜炎大鼠模型，選擇將懸濁液注入角膜接觸鏡鏡片與角膜層之間，其操作簡單，時間短，建模成功率較高。

研究表明，多種細(xì)胞因子參與了真菌性角膜炎的發(fā)生和發(fā)展，細(xì)胞因子表達(dá)水平與炎癥的發(fā)生和發(fā)展以及角膜損傷的嚴(yán)重具有相關(guān)性[10]。有研究指出，大黃素能夠提高角膜閉鎖蛋白表達(dá)量，保護(hù)角膜屏障完整，降低中性粒細(xì)胞的浸潤程度，減少角膜損傷[11]。本研究結(jié)果顯示，大黃素組大鼠角膜炎癥指數(shù)和角膜炎癥細(xì)胞計數(shù)降低，說明大黃素可以降低大鼠角膜炎癥指數(shù)，減少角膜炎癥細(xì)胞數(shù)量。高紅剛等[12]指出，大黃素能夠抑制眼部堿燒傷炎癥。本研究也說明大黃素的抑制炎癥作用明顯。IL-6是炎癥發(fā)熱反應(yīng)的重要因子，某些腫瘤細(xì)胞會自身誘導(dǎo)形成IL-6，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長，IL-6在人體內(nèi)參與多種炎癥反應(yīng)和疾病，屬于促炎因子[13-14]。TNF-α能夠刺激免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素等炎癥因子，但是TNF-α在機(jī)體中過多表達(dá)，會促使T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，從而造成機(jī)體細(xì)胞的損壞[15]。ICAM-1是一種重要的黏附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化過程，促進(jìn)細(xì)胞生長和分化，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[16]。本研究結(jié)果顯示，大黃素組TNF-α、IL-6、ICAM-1水平降低，說明大黃素可以改善大鼠的TNF-α、IL-6、ICAM-1水平，起到抑制炎癥的作用。Chen等[17]指出，大黃素能夠緩解角膜水腫和炎性細(xì)胞浸潤程度，降低角膜組織中TNF-α、ICAM-1水平，與本研究結(jié)果保持一致。

圖2三組大鼠PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)Western blot圖。

本研究顯示，大黃素組PPAR蛋白表達(dá)升高，MAPK、NF-κB表達(dá)降低，說明大黃素對MAPK、NF-κB有抑制作用，促進(jìn)PPAR蛋白表達(dá)，大黃素通過抑制NF-κB活化，能夠減少炎性細(xì)胞因子的釋放，從而對組織起到一定的保護(hù)作用。陳國玲等[6]研究也指出，大黃素能改善其NF-κB蛋白表達(dá)，本研究與其保持一致。NF-κB可以與多種基因啟動因子進(jìn)行特異性結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，NF-κB通過對下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，起到對炎癥因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用[18-19]。PPAR、MAPK是NF-κB重要的調(diào)節(jié)蛋白[20]。通過本研究說明，大黃素其可能的作用機(jī)制是激活NF-κB相關(guān)通路，控制PPAR、MAPK表達(dá)，通過抑制NF-κB調(diào)控TNF-α、IL-6、ICAM-1水平，抑制炎性釋放，降低炎性反應(yīng)。

2李冰，陳一強，孔晉亮，等.黃芩素聯(lián)合兩性霉素B對煙曲霉菌生物被膜的體外作用.山東醫(yī)藥 2016；56(4):5-7

5任毅，甘勝偉，李平華，等.Dectin-1和 TLR4在煙曲霉菌性角膜炎大鼠角膜組織中的表達(dá)及其在角膜炎發(fā)病中的作用.吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版) 2015；41(6):1176-1180