周妍君　賈曉炯　何建春　夏云

[摘要] 目的 探究亞胺培南異質(zhì)性耐藥陰溝腸桿菌的臨床特征和感染危險因素。 方法 采用病例對照研究，收集2014年1月～2016年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者無菌體液標(biāo)本中分離的非重復(fù)陰溝腸桿菌138株，其中陰溝腸桿菌亞胺培南異質(zhì)性耐藥菌株作為實驗組（115株），非異質(zhì)性耐藥菌株作為對照組（23株）。采用K-B法進行異質(zhì)性耐藥初篩，PAP試驗對異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象加以確認(rèn)，并用統(tǒng)計學(xué)方法對患者病例資料進行危險因素分析。 結(jié)果 收集標(biāo)本中有115株（83.3%）陰溝腸桿菌對亞胺培南產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象：從送檢科室看，肝膽外科科室分離率最高為34.1%;從分離的標(biāo)本類型看，多數(shù)來源于血液標(biāo)本，分離率為35.5%。多因素分析結(jié)果顯示：男性（OR = 3.40，95%CI：1.16～9.92）、導(dǎo)尿管（OR = 3.74，95%CI：1.25～11.24）、中心靜脈置管（OR = 3.65，95%CI：1.22～10.89）以及碳青霉烯類抗生素使用（OR = 6.79，95%CI：1.48～31.14）是引起亞胺培南異質(zhì)性耐藥陰溝腸桿菌相關(guān)感染的獨立危險因素（P < 0.05）。 結(jié)論 臨床應(yīng)嚴(yán)格把握抗菌藥物的適應(yīng)證，規(guī)范侵入性操作，從而減少耐藥菌的出現(xiàn)和流行。

[關(guān)鍵詞] 陰溝腸桿菌;亞胺培南;異質(zhì)性耐藥;危險因素

[中圖分類號] R378? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0147-04

Study on clinical characteristics and risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae

ZHOU Yanjun1? ?JIA Xiaojiong1? ?HE Jianchun1? ?XIA Yun2

1.The First Clinical College of Chongqing Medical University， Chongqing? ?400016， China; 2.Department of Laboratory， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing? ?400016， China

[Abstract] Objective To investigate clinical characteristics and risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae. Methods By means of case-control study， a total of 138 strains of Enterobacter cloacae isolated from the aseptic fluid samples of hospitalized patients from the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2014 to December 2016 were collected. Imipenem-resistant strains of Enterobacter cloacae were used as experimental group （115 strains） and non-heterogeneous drug-resistant strains as control group （23 strains）. The disk diffusion was used for screening heteroresistance and PAP test confirmed the heteroresistance. The risk factors of patients'case data were analyzed by statistical method. Results There were 115 strains （83.3%） showed heteroresistance to imipenem. The rate of separation of hepatobiliary department was 34.1%. From the type of isolated specimens， most of them were derived from blood samples and the isolation rate was 35.5%. The results of multivariate analysis showed that male （OR = 3.40， 95%CI： 1.16-9.92）， catheter （OR = 3.74， 95%CI： 1.25-11.24）， central venous catheter （OR = 3.65， 95%CI： 1.22-10.89） and use of carbapenem antibiotics （OR = 6.79， 95%CI： 1.48-31.14） were independent risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae （P < 0.05）. Conclusion Clinical indications for antimicrobial agents should be strictly controlled and invasive procedures should be regulated to reduce the emergence and prevalence of heteroresistant bacteria.

[Key words] Enterobacter cloacae; Imipenem; Heteroresistance; Risk factor

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種常見的發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，通?？梢鹌つw軟組織感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及敗血癥等[1-2]。由于廣泛應(yīng)用廣譜抗生素，多重耐藥陰溝腸桿菌逐年增多，加之陰溝腸桿菌具有可移動的基因元件，耐藥機制復(fù)雜，給臨床診治帶來了巨大的挑戰(zhàn)[3]。碳青霉烯類（Carbapenems）藥物是一種新型β-內(nèi)酰胺類抗生素，被認(rèn)為是近年來治療耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線，其中亞胺培南是臨床使用率最高的一種碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、有耐酶或抑酶特點，對革蘭陰性桿菌具有較強殺菌作用[4-5]。自從1997年Hiramatsu等學(xué)者最早報道了萬古霉素異質(zhì)性耐藥的金黃色葡萄球菌后[6]，細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象受到全球抗感染界的廣泛關(guān)注，這種在同一遺傳背景下同一細(xì)菌克隆亞群對某種抗菌藥物敏感性各不相同的耐藥現(xiàn)象，就是異質(zhì)性耐藥[7]。相關(guān)研究已證實[8-9]，異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌從敏感階段到耐藥階段進行自然進化的一種中間階段，若不及時抑制將進展成完全耐藥。因此，異質(zhì)性耐藥問題應(yīng)引起足夠的重視和關(guān)注。本研究主要是了解目前國內(nèi)異質(zhì)性耐藥的流行情況和相關(guān)臨床特征，確證其感染獨立危險因素，為臨床合理使用抗生素、減緩耐藥菌出現(xiàn)、加強院內(nèi)感染監(jiān)測和控制提供理論依據(jù)和防控措施。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2014年1月～2016年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）住院患者非重復(fù)無菌體液標(biāo)本（血液、腹腔積液、胸腔積液等）陰溝腸桿菌株138株。亞胺培南異質(zhì)性耐藥陰溝腸桿菌（Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae，IPM-HR-ECL）菌株作為實驗組（115株），非異質(zhì)性耐藥菌株作為對照組（23株），剔除亞胺培南耐藥菌株。從標(biāo)本來源看，血液49株，膽汁31株，引流液18株等。從科室分布來看，肝膽外科47株，重癥監(jiān)護室17株，骨科17株等。以上所有菌株均經(jīng)Vitek2 Compact和vitek MS全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2 試劑與儀器

所用藥敏紙片（IMP，10 μg/片）、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母均購自O(shè)xiod公司，抗生素粉末（IMP）購自Sigma公司，MH平板購自重慶龐通醫(yī)療器械公司，血平板購自鄭州安圖生物公司，Vitek2 Compact型全自動細(xì)菌分析儀購自法國梅里埃生物公司。

1.3 異質(zhì)性耐藥初篩

K-B藥敏試驗：采用Mueller-Hinton瓊脂（MHA）培養(yǎng)基，調(diào)菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，采用含有10 μg亞胺培南的藥敏紙片進行試驗，在35℃下CO2孵箱孵育48 h后測量抑菌圈直徑，并按CLSI 2015版本進行藥敏結(jié)果判讀;異質(zhì)性耐藥—抑菌圈內(nèi)有菌落生長，非異質(zhì)性耐藥—抑菌圈內(nèi)沒有菌落生長。

1.4 異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象確證

菌譜分析（PAP）試驗：以K-B初篩為呈現(xiàn)異質(zhì)性耐藥的菌株為對象進一步采用PAP（金標(biāo)準(zhǔn)[7]）來確證碳青霉稀異質(zhì)性耐藥表型，并以1株完全敏感株（S）和1株完全耐藥菌（FR）作為對照，隨機選取5株異質(zhì)性耐藥菌（HR），觀察菌株的PAP曲線特點。具體實驗方法如下：調(diào)節(jié)菌懸液麥?zhǔn)蠞舛戎?.5（約108 CFU/mL）涂抹于含IPM（濃度為0～128 μg/mL）的MH平板上，37℃孵育48 h，計數(shù)CFU值N后換算成對數(shù)值。以IPM濃度為橫坐標(biāo)，logN為縱坐標(biāo)繪制半對數(shù)圖。在高于抗生素耐藥折點濃度下有菌落生長，PAP曲線介入完全敏感菌株和完全耐藥菌株之間，且細(xì)菌在最高非抑菌抗菌藥物濃度到最低完全抑菌抗菌藥物濃度之間的差異在8倍及其以上，即可判定為異質(zhì)性耐藥菌株。

1.5 危險因素調(diào)查

所有病例資料均從檢驗科LIS系統(tǒng)和電子病歷系統(tǒng)收集得到。收集的資料：①一般情況（年齡、性別、是否入住ICU等）;②慢性基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、慢性腎病、肝病、冠心病等）;③感染前進行侵入性操作情況（腸外營養(yǎng)、內(nèi)置引流管、導(dǎo)尿管、中心靜脈置管、感染前手術(shù)史、機械通氣等）;④抗生素使用情況（糖肽類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、喹諾酮類等）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。單因素分析中計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗。多因素分析采用多元Logistic回歸分析，計算危險因素的P值、優(yōu)勢比（OR）、95%CI。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

我院收集的138株陰溝腸桿菌中超過50%的標(biāo)本來自外科（90/138，65.2%），主要為肝膽外科（47/138，34.1%）、重癥醫(yī)學(xué)科（17/138，12.3%）和骨科（17/138，12.3%）等三個科室。從標(biāo)本分布來看，這些菌株主要來源于血液（49/138，35.5%），膽汁（31/138，22.5%），引流液（18/138，13.0%），胸腔積液（9/138，6.5%）等無菌體液標(biāo)本。從異質(zhì)性耐藥初篩結(jié)果來看，這些菌株中有115株（115/138，83.3%）對亞胺培南具有異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。從異質(zhì)性耐藥發(fā)生率來看，IPM-HR-ECL從2014年的78.9%（30/38）到2015年的83.0%（39/47），再增長到2016年的86.8%（46/53），呈明顯增長趨勢。

2.2 異質(zhì)性耐藥表型初篩

K-B藥敏紙片法結(jié)果顯示，亞胺培南紙片抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)了許多菌落（透射光下肉眼可見），可初步認(rèn)為這些菌落在抗生素壓力下具有潛在耐藥性，為異質(zhì)性耐藥菌落。見圖1。

2.3 PAP驗證

IPM-HR-ECL的PAP曲線如圖2所示：101號敏感對照在最低抑菌濃度前后的培養(yǎng)中，PAP曲線突然下降至水平，21、45、66、71、98號（IPM-HR實驗株）的PAP曲線逐漸緩慢下降，即隨著IPM濃度的增加，菌株在平板生長的菌落數(shù)逐漸減少;88號（FR對照株）先在一定IPM濃度范圍內(nèi)基本保持水平，到達(dá)最低抑菌濃度后，曲線也是突然下降至0，基本不再有菌落生長。

2.4 IPM-HR-ECL感染的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示：男性、導(dǎo)尿管、中心靜脈置管以及碳青霉烯類抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的主要危險因素（P < 0.05）。見表1。

2.5 IPM-HR-ECL感染的多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示：男性（OR = 3.40，95%CI：1.16～9.92）、導(dǎo)尿管（OR = 3.74，95%CI：1.25～11.24）、中心靜脈置管（OR = 3.65，95%CI：1.22～10.89）以及碳青霉烯類抗生素使用（OR = 6.79，95%CI：1.48～31.14）是引起IPM-HR-ECL相關(guān)感染的獨立危險因素（P < 0.05）。見表2。

3 討論

陰溝腸桿菌作為院內(nèi)感染常見的條件病原菌之一，在機體抵抗力下降時可引起各種醫(yī)院感染。異質(zhì)性耐藥被認(rèn)為是細(xì)菌進展至完全耐藥的中間階段[10]。由于臨床藥敏試驗往往不能檢出耐藥亞群，給臨床用藥帶來了困難。目前國外陰溝腸桿菌異質(zhì)性耐藥的研究僅有1例[11]。國內(nèi)還未報道過陰溝腸桿菌對亞胺培南異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。

我院收集的138株亞胺培南異質(zhì)性耐藥的陰溝腸桿菌，超過50%的標(biāo)本來自外科，說明外科手術(shù)及侵入性操作可能增感染風(fēng)險。所有菌株對亞胺培南的異質(zhì)性耐藥率為83.3%，耐藥形式較為嚴(yán)峻。另外異質(zhì)性耐藥率呈明顯增長趨勢，這可能與細(xì)菌長期暴露在抗生素壓力下，敏感菌株向耐藥菌株誘導(dǎo)分化有關(guān)[12-13]。

男性、導(dǎo)尿管、中心靜脈置管和碳青霉烯類抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的主要危險因素。其中中心靜脈置管和導(dǎo)尿管是IPM-HR-ECL感染的獨立危險因素，這與國內(nèi)外報道基本一致[14-15]。中心靜脈置管及導(dǎo)尿管容易附著多種條件致病菌，形成生物膜，增加感染率[16-17]。加上患者在長期使用多種抗生素作用下，更加容易感染異質(zhì)性耐藥菌株。此外，男性也是IPM-HR-ECL感染的獨立危險因素，在本研究中超過80%的男性患者有過手術(shù)史和侵入性操作，其感染原因可能是手術(shù)過程中會改變患者功能狀態(tài)，破壞機械屏障，患者自身免疫功能降低，術(shù)后患者置管，均能造成患者感染率增大[18-19]。因此，臨床工作者應(yīng)重視無菌操作，盡早拔除引流管，合理使用抗生素，加強侵入性操作留置管的護理，防止感染發(fā)生。

碳青霉烯抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的獨立危險因素。細(xì)菌在抗生素的選擇壓力下，敏感菌被抑制或殺滅，耐藥菌大量繁殖成為優(yōu)勢菌[20-21]。因此臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合藥敏實驗合理用藥和聯(lián)合用藥，避免經(jīng)驗性用藥，尤其是濫用碳青霉烯類抗生素，以減少異質(zhì)性耐藥菌株的產(chǎn)生。

綜上所述，由于異質(zhì)性耐藥的特殊性，臨床醫(yī)生應(yīng)嚴(yán)格把握抗菌藥物的適應(yīng)證，合理用藥和聯(lián)合用藥，同時加強對陰溝腸桿菌的監(jiān)控。其次，減少不必要的侵入性操作和腸外營養(yǎng)，對提高臨床治愈率及預(yù)防陰溝腸桿菌異質(zhì)性耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。

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（收稿日期：2019-01-03? 本文編輯：李亞聰）