王桂平 梁杰聰 李智斌 張彥燾

中圖分類號 R361+.3;R734 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2931-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.11

摘 要 目的：研究貝特類藥物苯扎貝特和非諾貝特對肺腺癌PC-9細胞增殖和c-myc表達的影響。方法：采用CCK8法檢測苯扎貝特和非諾貝特（12.5、25、50、100、200 μmol/L）作用48 h對PC-9細胞存活率的影響。另將PC-9細胞分為給藥組和對照組，給藥組分別加入低、中、高濃度（25、50、100 μmol/L）的苯扎貝特和非諾貝特，對照組加入二甲基亞砜，作用48 h后，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡情況;熒光定量聚合酶鏈法（qRT-PCR）檢測細胞中c-myc mRNA相對表達量;Western blot法檢測細胞中c-myc蛋白相對表達量。結果：上述濃度苯扎貝特作用下PC-9細胞存活率分別為（80.76±3.2）%、（74.35±5.06）%、（62.8±1.23）%、（59.03±1.55）%、（39.8±1.01）%;而非諾貝特作用下PC-9細胞存活率分別為（74.46±1.30）%、（61.91±4.77）%、（48.95±2.8）%、（37.05±1.55）%、（32.49±1.36）%。與對照組比較，苯扎貝特和非諾貝特的中、高濃度組G1期細胞比率均明顯增加，苯扎貝特和非諾貝特的低、中、高濃度組的細胞凋亡率均明顯增加，c-myc mRNA和蛋白相對表達量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：苯扎貝特和非諾貝特可抑制PC-9細胞增殖，并下調(diào)c-myc表達。

關鍵詞 苯扎貝特;非諾貝特;肺腺癌PC-9細胞;半數(shù)抑制濃度;c-myc;抑制作用

Effects of Bezafibrate and Fenofibrate on the Proliferation of Lung Adenocarcinoma PC-9 Cells and the Expression of c-myc

WANG Guiping1，LIANG Jiecong2，LI Zhibin1，ZHANG Yantao1（1.Dept. of Pharmacy， Guangzhou Health Science College， Guangzhou 510180， China;2.Dept. of Surgery， Guangzhou Women and Children’s Medical Center， Guangzhou 510623， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of bezafibrate （BEZ） and fenofibrate （FEN） on the proliferation of lung adenocarcinoma PC-9 cells and the expression of c-myc. METHODS： The effects of BEZ and FEN （12.5， 25， 50， 100， 200 ? ? ? μmol/L） on the survival rate of PC-9 cells were detected by CCK8 method. PC-9 cells were divided into administration group and control group. Administration group was given low， medium and high concentration （25， 50， 100 μmol/L） of BEZ and FEN; control group was treated with dimethyl sulfoxide for 48 h. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. qRT-PCR was used to detect mRNA relative expression of c-myc in cells. The protein relative expression of c-myc in cells were detected by Western blot assay. RESULTS： The survival rates of PC-9 cells were （80.76±3.2）%， （74.35±5.06）%， （62.8±1.23）%， （59.03±1.55）%， （39.8±1.01）% under the action of above concentration of BEZ; and the survival rates of PC-9 cells were （74.46±1.30）%， （61.91±4.77）%， （48.95±2.8）%， （37.05±1.55）%， （32.49±1.36）% under the action of FEN. Compared with control group， G1 phase cell ratio increased significantly in medium and high concentration groups of BEZ and FEN; the apoptotic rate of PC-9 cells was increased significantly in low， medium and high concentration groups of BEZ and FEN; mRNA and protein relative expression of c-myc were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： BEZ and FEN can inhibit the proliferation of PC-9 cells， and down-regulate c-myc expression.

KEYWORDS ? Bezafibrate; Fenofibrate; Lung adenocarcinoma PC-9 cell; Half inhibitory concentration; c-myc; Inhibitory effect

肺腺癌（Lung adenocarcinoma）屬于非小細胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的30%～40%，由于70%～80%的肺癌發(fā)現(xiàn)時已進展為晚期，故化療仍是絕大多數(shù)肺癌患者主要的治療手段[1]。但目前絕大多數(shù)肺癌患者化療預后并不理想，總體5年生存率僅為10%～15%，肺癌的治療藥物主要包括鉑類藥物、第三代細胞毒藥物（吉西他濱、紫杉醇、培美曲塞等）、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑及EGFR單抗等[2-3]。因此，發(fā)現(xiàn)新的、更有效的、更安全的化療藥物，對延長肺癌患者的生存時間及降低死亡率有著迫切的臨床需要。

貝特類藥物如苯扎貝特（Bezafibrate）、非諾貝特（Fenofibrate）等具有降低三酰甘油、防止血液凝固、促進血栓溶解、減少動脈粥樣硬化性炎癥等作用，常用于動脈粥樣硬化的預防和治療[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，貝特類藥物也具有良好的抗腫瘤作用，如非諾貝特被報道對乳腺癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種人類腫瘤具有良好的抗腫瘤作用[4-7];苯扎貝特被報道對白血病等腫瘤具有良好的抗腫瘤作用[8-9]。然而，目前有關苯扎貝特和非諾貝特抗肺癌的研究很少，本文主要研究苯扎貝特和非諾貝特對肺腺癌細胞PC-9增殖和c-myc表達的影響，為貝特類藥物在腫瘤治療中的應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HERACELL150i型CO2培養(yǎng)箱、MK3型酶標儀和7500 型熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（賽默飛世爾儀器有限公司）;Tanon-1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;22331 Hamburg型核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

苯扎貝特對照品和非諾貝特對照品（美國Sigma公司，批號：B7273、F6020，純度：>98%、>99%）;Cell Counting Kit8（CCK8）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0038）;兔抗人c-myc單克隆抗體 （英國Abcam公司，批號：32072）;辣根過氧化物（HRP）標記的鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰?，批號：KC-5G5）;HRP標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（經(jīng)小鼠、人免疫球蛋白吸附）（美國Southern Biotech公司，批號：4050-05）;96孔聚苯乙烯酶標板（美國Corning公司）;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基及青鏈霉素（美國Hyclone公司，批號：SH30087.01、SH30809.01B、SH30010）;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）;其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

人肺腺癌細胞株PC-9購自中山大學細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，傳代備用。

2 方法

2.1 細胞增殖的檢測

參考文獻[10]方法，采用CCK8法檢測細胞存活率，具體操作按說明書進行。取對數(shù)生長期PC-9細胞，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制備單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度為5×105 L-1，每孔200 μL，試驗設對照組、苯扎貝特組和非諾貝特組。將苯扎貝特和非諾貝特溶解于二甲基亞砜（DMSO）溶液（體積比為0.5%）中，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至所需濃度。對照組細胞中加入DMSO溶液，苯扎貝特組細胞中依次加入12.5、25、50、100、200 μmol/L的苯扎貝特溶液，非諾貝特組細胞中依次加入12.5、25、50、100、200 μmol/L的非諾貝特溶液，作用48 h后，各孔加入CCK8混合液10 μL，37 ℃孵育3 h，在酶標儀450 nm波長處測定光密度（OD），試驗重復3次。計算細胞存活率（%）=（加藥組OD/對照組OD）×100%。

2.2 細胞周期與細胞凋亡率的檢測

參考文獻[10]方法，采用流式細胞法檢測細胞周期與細胞凋亡率。 取對數(shù)生長期的PC-9細胞，調(diào)整細胞密度為1×106 mL-1，接種2 mL于6孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。試驗設對照組，苯扎貝特低、中、高濃度組和非諾貝特低、中、高濃度組，對照組細胞中加入DMSO溶液，苯扎貝特低、中、高濃度組細胞中依次加入25、50、100 μmol/L的苯扎貝特溶液，非諾貝特低、中、高濃度組細胞中依次加入25、50、100 μmol/L的非諾貝特溶液，作用48 h后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞懸液，然后加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4 ℃放置24 h以上。按試劑盒操作流程，加入碘化丙啶（PI）和膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC），分別檢測各組細胞周期與凋亡率。

2.3 細胞中c-myc mRNA表達的檢測

采用qRT-PCR法檢測細胞中c-myc mRNA表達水平。試驗分組與給藥情況同“2.2”項下方法操作，作用48 h后，收集細胞，加入1 mL Trizol緩沖液，抽提樣品中總RNA，并對所提取的RNA進行純度檢測及總RNA完整性檢測。反應條件：50 ℃ 2 min; 95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40個循環(huán)。融解曲線分析：溫度60～95 ℃，每個樣品重復3次。以GAPDH為內(nèi)參，熒光信號由ABI PRISM? 7500型qRT-PCR儀檢測，最后按2ΔΔct法計算c-myc mRNA的相對表達量，ΔΔct=Δct給藥組- ? ?Δct對照組。引物序列與片段長度見表1。

2.4 Western blot檢測c-myc蛋白表達

參考文獻[11]方法，采用Western blot法檢測細胞中c-myc蛋白表達水平。試驗分組與給藥情況同“2.2”項下方法操作，作用48 h后，收集細胞，細胞中加入100 μL裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟 ）進行細胞裂解，提取蛋白并測定總蛋白濃度。以10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉PVDF膜，封閉后，加入兔抗人c-myc單克隆抗體（稀釋比例：1 ∶ 10 000），4 ℃下放置過夜。洗膜后，將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（經(jīng)小鼠、人免疫球蛋白吸附）（稀釋比例：1 ∶ 10 000）共同孵育1 h后，將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，并使反應持續(xù)5 min，暗盒顯影。通過Image J軟件分析目標條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參，計算c-myc蛋白相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)以x±s表示，應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組比較采用ANOVA方差分析，方差齊時采用LSD檢驗進行兩兩樣本之間的多重比較，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗進行多重比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞存活率

12.5、25、50、100、200 μmol/L的苯扎貝特作用下PC-9細胞存活率分別為（80.76±3.2）%、（74.35±5.06）%、（62.8±1.23）%、（59.03±1.55）%、（39.8±1.01）%;而非諾貝特作用下PC-9細胞存活率分別為（74.46±1.30）%、（61.91±4.77）%、（48.95±2.8）%、（37.05±1.55）%、（32.49±1.36）%。苯扎貝特和非諾貝特均可不同程度降低PC-9細胞的存活率，并且苯扎貝特和非諾貝特的抑制作用呈濃度依賴性，隨濃度的增加，其抑制作用也增強。與苯扎貝特組比較，非諾貝特對PC-9細胞的增殖抑制作用更強，其中濃度在25～100 μmol/L內(nèi)兩藥的抑制作用差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），12.5和200 μmol/L時兩藥的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。不同濃度苯扎貝特和非諾貝特作用下PC-9細胞存活率曲線見圖1。

3.2 細胞周期

與對照組比較，苯扎貝特中、高濃度組和非諾貝特中、高濃度組細胞中G1期細胞占比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），苯扎貝特低濃度組和非諾貝特低濃度組細胞中G1期細胞占比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與苯扎貝特高濃度組比較，非諾貝特高濃度組細胞中G1期細胞占比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;兩藥低、中濃度組細胞中G1期細胞占比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果表明，苯扎貝特和非諾貝特均可誘導PC-9細胞產(chǎn)生G1期阻滯，阻滯誘導作用呈濃度依賴性，其中高濃度非諾貝特阻滯作用最明顯。各組細胞的周期分布流式圖見圖2，不同周期細胞占比的檢測結果見圖3。

3.3 細胞凋亡

與對照組比較，苯扎貝特低、中、高濃度組和非諾貝特低、中、高濃度組細胞的凋亡率均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但凋亡率數(shù)值不大。與苯扎貝特組比較，相應濃度非諾貝特組細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果表明，苯扎貝特和非諾貝特均可誘導PC-9細胞凋亡，凋亡誘導作用呈濃度依賴性，但誘導作用不強。各組細胞凋亡的散點圖見圖4，凋亡率的檢測結果見圖5。

3.4 細胞中c-myc mRNA表達

與對照組比較，苯扎貝特低、中、高濃度組和非諾貝特低、中、高濃度組細胞中c-myc mRNA的相對表達量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與苯扎貝特高濃度組比較，非諾貝特高濃度組細胞中c-myc mRNA的相對表達量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;兩藥低、中濃度組細胞中c-myc mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組細胞中c-myc mRNA相對表達量的檢測結果見圖6。

3.5 細胞中c-myc蛋白表達

與對照組比較，苯扎貝特低、中、高濃度組和非諾貝特低、中、高濃度組細胞中c-myc蛋白相對表達量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與苯扎貝特組比較，相應濃度非諾貝特組細胞中c-myc蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組細胞中c-myc蛋白表達的電泳圖見圖7，蛋白相對表達量的檢測結果見圖8。

4 討論

貝特類藥物屬于苯氧芳酸類降脂藥，廣泛應用于臨床降脂治療，對控制動脈粥樣硬化、心血管疾病、缺血再灌注損傷等有較好療效。貝特類藥物也是重要的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）α激活劑，PPARα受體通路與腫瘤發(fā)生關系密切。已有研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特等PPARα激活劑已被證實對多種人類腫瘤，包括肝癌、前列腺癌等腫瘤具有抗癌作用[4-12]。本研究結果顯示，苯扎貝特和非諾貝特均可不同程度抑制PC-9細胞的生長和誘導PC-9細胞產(chǎn)生G1期阻滯，其中非諾貝特的抑制作用強于苯扎貝特。此外，試驗也發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特和非諾貝特可一定程度誘導PC-9細胞產(chǎn)生細胞凋亡，細胞凋亡誘導作用較弱，此與文獻[13]報道一致，說明貝特類可能主要不是通過誘導細胞凋亡而產(chǎn)生抗肺腺癌作用。現(xiàn)有的研究也顯示，非諾貝特等貝特類藥物對不同腫瘤細胞凋亡誘導效應存在差異，例如非諾貝特對乳腺癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及前列腺癌的細胞凋亡誘導效應較明顯[4-8]。

c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一，主要參與細胞增殖、去分化、轉化、細胞凋亡及細胞周期調(diào)控等生物學過程。c-myc在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，c-myc可通過多種方式影響細胞周期G1期關鍵點的調(diào)控，例如c-myc可直接活化細胞周期蛋白（Cyclin）D2和周期蛋白依賴性激酶（CDK）4，或是通過細胞分裂周期基因（CDC）25活化CDK2和CDK4，從而促進G1期進展到S期;相反，抑制c-myc的表達，則可阻滯細胞周期G1期進展[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特、非諾貝特兩藥均可不同程度下調(diào)c-myc mRNA和蛋白表達，其中非諾貝特對c-myc表達的抑制作用更明顯，提示苯扎貝特和非諾貝特可能是通過下調(diào)c-myc的表達，從而阻滯PC-9細胞周期G1期進展。然而，貝特類藥物抑制c-myc的表達是通過何種途徑阻滯細胞周期G1期進展還需要進一步實驗研究證實。目前，國內(nèi)外學者的研究表明，非諾貝特可通過多種機制誘導細胞周期G1期阻滯，例如通過上調(diào)p21、p27/Kip1表達和下調(diào)Cyclin D1和Cdk4表達引起乳癌 MDA-MB-231細胞G1期阻滯[15];通過抑制蛋白激酶B（Akt）的磷酸化水平而誘導肝癌Huh7細胞產(chǎn)生G1期和G2期阻滯[16];通過抑制核轉錄因子κB（NF- ?κB）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）活性誘導肺癌A549細胞產(chǎn)生G1期阻滯[13]。

綜上，苯扎貝特和非諾貝特可抑制PC-9細胞增殖，下調(diào)c-myc表達。

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（收稿日期：2019-06-19 修回日期：2019-09-10）

（編輯：鄒麗娟）