沈潔 王琴 熊維建 徐沖

中圖分類號 R932;R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2327-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.05

摘 要 目的：建立同時(shí)測定參芪延腎顆粒中淫羊藿藥材中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ 6個(gè)黃酮類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法，色譜柱為Waters Symmetry C18，流動相為乙腈-水 （梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為270 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在外標(biāo)法的基礎(chǔ)上分別采用多點(diǎn)校正法及斜率校正法建立各成分與淫羊藿苷（參照物）的相對校正因子（fk/s）以計(jì)算各成分含量;比較基于HPLC法的外標(biāo)法與多點(diǎn)校正法及斜率校正法所得4批參芪延腎顆粒樣品中6個(gè)黃酮類成分含量的差異，驗(yàn)證一測多評法的可行性及準(zhǔn)確性。結(jié)果：朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.03～50.80、4.34～108.60、2.26～56.40、4.14～103.60、4.24～106.00、1.78～44.60 μg/mL （r均為0.999 5）;檢測限分別為65.80、71.49、74.26、68.79、70.56、86.09 ng/mL;定量限分別為196.62、213.63、223.72、208.46、215.96、255.88 ng/mL;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%（n=6）;平均回收率為96.03%～99.04%（RSD為0.65%～1.04%，n=6）;采用多點(diǎn)校正法，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ的fk/s分別為0.837、0.818、0.845、0.831、1.387;采用斜率校正法，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ的fk/s分別為0.835、0.815、0.851、0.829、1.419。采用一測多評兩種校正法與外標(biāo)法所得含量結(jié)果比較，無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：建立的HPLC-一測多評法結(jié)果準(zhǔn)確，可應(yīng)用于參芪延腎顆粒中淫羊藿藥材中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ6個(gè)黃酮類成分的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 參芪延腎顆粒;淫羊藿;淫羊藿苷;黃酮類成分;一測多評法;高效液相色譜法;含量測定;質(zhì)量控制

Content Determination of 6 Flavonoids in Epimedium brevicornu from Shenqi Yanshen Granules Based on HPLC-QAMS

SHEN Jie，WANG Qin，XIONG Weijian，XU Chong（Dept. of Pharmacy， Chongqing Hospital of TCM， Chongqing 400021， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a HPLC method for simultaneous determination of 6 flavonoids in Epimedium brevicornu from Shenqi yanshen granules， such as epimedin A1， epimedin A， epimedin B， epimedin C， icariin and baohuoside Ⅰ. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was 25 ℃， and detection wavelength was 270 nm. The sample size was 10 μL. Relative correction factors （fk/s） of each component to icariin （reference substance） were established by multi-point correction method and slope correction method on the basis of external standard method to calculate the contents of each component. The contents of 6 flavonoids in 4 batches of Shenqi yanshen granules determined by HPLC external standard method were compared with by multi-point correction method and slope correction method. Feasibility and accuracy of quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS） were validated. RESULTS： The linear range of epimedin A1， epimedin A， epimedin B， epimedin C， icariin and baohuoside Ⅰ were 2.03-50.80 μg/mL （r=0.999 5）， 4.34-108.60 μg/mL （r=0.999 5）， 2.26-56.40 μg/mL （r=0.999 5）， 4.14-103.60 μg/mL （r=0.999 5）， 4.24-106.00 μg/mL （r=0.999 5）， 1.78-44.60 μg/mL （r=0.999 5）， respectively， the limits of detection were 65.80， 71.49， 74.26， 68.79， 70.56， 86.09 ng/mL， respectively; the limits of quantification were 196.62， 213.63， 223.72， 208.46， 215.96， 255.88 ng/mL， respectively; RSDs of precision， stability （24 h）， reproducibility tests were less than 2% （n=6）， respectively. The average recoveries were 96.03%-99.04% （RSDs were 0.65%-1.04%， n=6）. By multi-point correction method， fk/s of epimedin A1， epimedin A， epimedin B， epimedin C and baohuoside Ⅰ were 0.837， 0.818， 0.845， 0.831， 1.387， respectively; by slope correction method， fk/s of them were 0.835， 0.815， 0.851， 0.829， 1.419， respectively. There was no significant difference in content determination results between two correction methods of QAMS and external standard （P>0.05）. CONCLUSIONS： Established HPLC- QAMS method is accurate and suitable for the quality control of epimedin A1， epimedin A， epimedin B， epimedin C， icariin and baohuoside Ⅰ in E. brevicornu from Shenqi yanshen granules.

KEYWORDS ? Shenqi yanshen granules; Epimedium brevicornu; Icariin; Flavonoid; QAMS; HPLC; Content determination; Quality control

參芪延腎方是我院腎病科臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方由紅參、淫羊藿、黃芪、大黃、生地、川芎、鱉甲等7種藥味組成，在我院主要用于慢性腎病3～4期腎衰的治療。方中的君藥淫羊藿具有溫補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋健骨的作用[1-2]，其主要化學(xué)成分以黃酮為主，如其中的淫羊藿總黃酮具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)人體免疫調(diào)節(jié)、抗衰老及抗心肌缺氧等作用[3-5]，而淫羊藿苷具有降低動脈粥樣硬化患者血栓形成幾率及調(diào)節(jié)血脂[6]、保護(hù)受損神經(jīng)元及恢復(fù)記憶力等藥理活性[7]，朝藿定 A～C則均顯示出一定的雌激素活性[8-9]，寶藿苷Ⅰ則具有抗腫瘤及提高免疫力的作用[10]。目前，淫羊藿藥材、飲片及含有淫羊藿的成方制劑主要以單指標(biāo)成分（淫羊藿苷）來控制質(zhì)量[11-12]，2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定淫羊藿藥材及飲片質(zhì)量控制檢測指標(biāo)為淫羊藿苷和總黃酮，炙淫羊藿飲片檢測指標(biāo)為淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ，巫山淫羊藿指標(biāo)性成分為朝藿定C[13]。然而，即便是同種來源，但產(chǎn)地不同的淫羊藿中化學(xué)成分含量亦存在較大差異[14]，僅以淫羊藿苷單一指標(biāo)作為質(zhì)量控制依據(jù)，無法準(zhǔn)確反映藥材或制劑的質(zhì)量。

一測多評法適用于用一個(gè)參照物（對照品價(jià)廉易得）同時(shí)實(shí)現(xiàn)對多個(gè)成分（對照品價(jià)高難得）的含量測定，是適合中藥多成分及整體作用特點(diǎn)的質(zhì)量評價(jià)模式[15]。故本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，建立起以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)性成分，得到朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ之間的相對校正因子（fk/s）的一測多評法，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定參芪延腎顆粒中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ的含量，并與外標(biāo)法的含量測定結(jié)果進(jìn)行比較分析，為參芪延腎顆粒質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀[包括二極管陣列檢測器（DAD）]、Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀[包括可變波長掃描紫外檢測器（VWD）]、Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀（包括DAD）（美國Agilent公司）;BP210S十萬分之一電子天平（德國 Sartorius公司）;JA3003J電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

朝藿定A1（批號：140147-77-9，純度：98.70%）、朝藿定A（批號：110623-72-8，純度：98.49%）、朝藿定B （批號：110623-73-9，純度：99.24%）、朝藿定C（批號：10642-44-9，純度：98.88%），上述對照品均購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司;淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，純度：94.2%）及寶藿苷Ⅰ對照品（批號：111852-201603，純度：99.9%） 均購自中國食品藥品檢定研究院;參芪延腎顆粒（自制，批號：180716、180724、180730、180802，規(guī)格：15 g/袋，臨床常用量：一日2次，2袋/次）;乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 ? ?μm）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0→10 min，19%A;10→20 min，19%～30%A;20→35 min，30%A;35→40 min，30%～40%A;40→70 min，40%A，再運(yùn)行5 min;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：270 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ對照品適量，加入甲醇制備成混合對照品溶液，其中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度分別為50.80、108.60、56.40、103.60、106.00、44.60 μg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取參芪延腎顆粒（批號：180716）研細(xì)過3號篩，取粉末0.5 g，精密稱定，加入稀乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz） 1 h，冷卻后稱質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 根據(jù)參芪延腎顆粒處方組成制備缺淫羊藿的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性考察

分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分色譜峰均可以達(dá)到基線分離，各峰之間分離度均大于1.5，理論板數(shù)以淫羊藿苷峰計(jì)大于1 500。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、5、10、15、25 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇定量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，得到線性關(guān)系，見表1。

2.5 檢測限及定量限考察

取“2.2.1”混合對照品溶液逐步稀釋并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各色譜峰，以信噪比 3 ∶ 1時(shí)確定檢測限，以信噪比10 ∶ 1時(shí)確定定量限。結(jié)果，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ檢測限分別為65.80、71.49、74.26、68.79、70.56、86.09 ?ng/mL;定量限分別為196.62、213.63、223.72、208.46、215.96、255.88 ng/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ的峰面積的RSD分別為0.19%、0.20%、0.41%、0.59%、0.24%、0.40%（n=6），結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取參芪延腎顆粒（批號：180716）分別在制備成供試品溶液后0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ的峰面積的RSD分別為0.23%、0.21%、0.17%、0.18%、0.25%、0.57%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取參芪延腎顆粒（批號：180716）細(xì)粉0.5 g，平行6份，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，計(jì)算得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ 含量的RSD分別為1.69%、1.69%、1.73%、1.76%、1.89%、1.44%（n=6），結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取適量的參芪延腎顆粒（批號：180716）細(xì)粉約0.25 g，各6份。分別加入相應(yīng)低、中、高量的朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ對照品，制備成供試品溶液，測定峰面積，計(jì)算得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ平均回收率分別為96.13%、97.77%、99.04%、96.03%、98.70%、98.91%，RSD%分別為0.65%、1.03%、0.87%、0.78%、0.75%、1.04%，詳見表2。

2.10 一測多評法

2.10.1 多點(diǎn)校正法 以不同進(jìn)樣體積（1、2、3、4、5、6 ? ?μL）進(jìn)樣，計(jì)算所得相對校正因子（fk/s），取其平均值作為定量的fk/s，fk/s=（cs×Ak）/（ck×As）;在此公式中，cs為參照物淫羊藿苷的質(zhì)量濃度，As為參照物淫羊藿苷的色譜峰峰面積，Ak為待測成分色譜峰的峰面積，ck為待測成分質(zhì)量濃度[16-17]。應(yīng)用多點(diǎn)校正法計(jì)算其他成分相對于參照物淫羊藿苷的fk/s，結(jié)果見表3。

2.10.2 斜率校正法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程X=Y/a計(jì)算X與Y的斜率之比即fk/s（fk/s=ak/as），其中as為參照物淫羊藿苷的斜率，ak為待測成分的斜率。應(yīng)用斜率校正法計(jì)算得到朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及寶藿苷Ⅰ相對于淫羊藿苷的fk/s分別為0.835、0.815、0.851、0.829、1.419。

2.10.3 fk/s的重現(xiàn)性 考察不同的色譜系統(tǒng)[Agilent 1260（DAD）、Agilent 1260 Ⅱ（VWD）、Agilent 1260 Ⅱ（DAD）]及不同的色譜柱（Diamonsil C18、Aligent C18、Phenomenex C18、ODS-3 C18、Waters C18）對fk/s（多點(diǎn)校正法）的影響。結(jié)果，各fk/s的RSD均<5%（n=6），不同儀器及不同色譜柱下的fk/s見表4。

2.10.4 待測成分色譜峰的定位 以淫羊藿苷峰為參照峰，計(jì)算不同儀器和不同色譜柱（同“2.10.2”項(xiàng)）項(xiàng)下朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及寶藿苷Ⅰ相對于淫羊藿苷的相對保留時(shí)間（tk/s=tk/ts）。結(jié)果，除距參照峰較遠(yuǎn)的朝藿定A1及寶藿苷Ⅰ外，其余fk/s的RSD均<5%（n=6），表明使用tk/s定位色譜峰較片面，受限于填料或柱型;另外，確認(rèn)色譜峰的定位應(yīng)結(jié)合峰形、峰面積比等因素[18]，不同儀器及不同色譜柱下各成分的tk/s見表5。

2.10.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 分別將4批樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ峰面積，分別采用外標(biāo)法及一測多評法中的2種方法計(jì)算6個(gè)成分的量。將外標(biāo)法與兩種一測多評法計(jì)算結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，外標(biāo)法與兩種一測多評法結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明外標(biāo)法與兩種一測多評法得到的結(jié)果具有極高的相似性;同時(shí)經(jīng)方差分析，其P值大于0.05，表明3種測定方法的計(jì)算結(jié)果之間并無顯著性差異，且各批樣品間3種測定方法含量結(jié)果的RSD<5%（n=3）。結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

由于本方中淫羊藿處方量遠(yuǎn)大于其他藥，且在實(shí)際生產(chǎn)研究中發(fā)現(xiàn)同一廠家不同批次的淫羊藿藥材中黃酮類化學(xué)成分含量存在較大差異，而單一指標(biāo)性成分的含量控制遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能真實(shí)地反映制劑質(zhì)量。故筆者選取淫羊藿藥材中6個(gè)黃酮類成分進(jìn)行測定，以期能夠更全面、真實(shí)地評價(jià)參芪延腎顆粒的質(zhì)量。

3.2 流動相的選擇

在前期試驗(yàn)中，筆者考察了流動相為乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸等的分離效果，通過比較圖譜發(fā)現(xiàn)三者為流動相時(shí)分離度及洗脫效果差異不明顯，最后綜合考慮設(shè)備、試劑成本及環(huán)保等因素，選擇乙腈-水為流動相體系進(jìn)行洗脫。

綜上，本試驗(yàn)選用淫羊藿藥材中含量較高、具有藥理活性的淫羊藿苷為參照物，且其對照品化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得，通過一測多評法，實(shí)現(xiàn)了對參芪延腎顆粒中淫羊藿中其他5個(gè)黃酮類成分朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量控制，同時(shí)采用3種測定方法對 4 批參芪延腎顆粒的這6 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行測定，結(jié)果表明，外標(biāo)法與一測多評法中的多點(diǎn)校正法與斜率校正法測定結(jié)果并無明顯差異，而后兩種方法具有簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

綜上，一測多評法應(yīng)用于參芪延腎顆粒中淫羊藿中6個(gè)黃酮類成分的質(zhì)量評價(jià)具有較強(qiáng)的可行性，筆者認(rèn)為該法也可推廣到其他淫羊藿藥材提取物及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制中。

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（收稿日期：2019-03-27 修回日期：2019-05-06）

（編輯：劉 萍）