符武島　曾敏　陳娟　馮光球　管頻　鐘春榮符武島＊，曾　敏 #，陳　娟，馮光球，管　頻，鐘春榮

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2187-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.06

摘 要 目的：探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。方法：以叔丁基過氧化氫（TBHP）處理H9C2心肌細胞構(gòu)建缺血再灌注細胞模型，采用MTS法考察經(jīng)不同劑量（3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）EGCG預(yù)處理后細胞的存活情況，并計算細胞存活率;采用Western blotting法檢測經(jīng)不同劑量（100、200 μmol/L）EGCG預(yù)處理后細胞中凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）的表達情況。將雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和EGCG組（5 mg/g），每組15只。假手術(shù)組和模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水，EGCG組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥12 h后，采用前降支結(jié)扎法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷小鼠模型。采用伊文思藍和TTC雙染色法觀察各組小鼠的心肌梗死面積，并計算梗死面積占橫截面積百分比，采用WST-1法檢測其血清超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，采用Western blotting法檢測其心肌組織中凋亡蛋白的表達（Bcl-2、Bax）以及通路相關(guān)蛋白[磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）]的磷酸化水平。結(jié)果：細胞試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞存活率、Bcl-2的相對表達量均顯著降低，Bax的相對表達量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，25、50、100、200 μmol/L EGCG組細胞存活率以及100、200 μmol/L EGCG組細胞Bcl-2的相對表達量均顯著升高，100、200 μmol/L EGCG組細胞Bax的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。動物實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠未見心肌組織缺血、心腔擴大等現(xiàn)象;模型組小鼠可見明顯的心肌梗死現(xiàn)象，其梗死面積占橫截面積百分比、血清MDA含量、心肌組織Bax的相對表達量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均較假手術(shù)組顯著升高，SOD活性和Bcl-2的相對表達量均較假手術(shù)組顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，EGCG組小鼠心肌梗死面積有所縮小，其梗死面積占橫截面積百分比、血清MDA含量、心肌組織Bax的相對表達量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均顯著降低，SOD活性和Bcl-2的相對表達量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：EGCG對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，這種作用可能與抑制心肌細胞凋亡、改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)控凋亡蛋白表達、降低PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 表沒食子兒茶素沒食子酸酯;心肌缺血再灌注損傷;凋亡;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路;H9C2心肌細胞;C57BL/6小鼠

Study on Mechanism of Epigallocatechin Gallate Alleviating Myocardial Ischemia-reperfusion Injury by Inhibiting Cardiomyocyte Apoptosis

FU Wudao，ZENG Min，CHEN Juan，F(xiàn)ENG Guangqiu，GUAN Pin，ZHONG Chunrong（Hainan Provincial People’s Hospital， Haikou 570311， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the protective effect and potential mechanism of epigallocatechin gallate （EGCG） on myocardial ischemia-reperfusion injury. METHODS： H9C2 cardiomyocytes were treated with tert-butyl hydroperoxide （TBHP） to establish ischemia-reperfusion cell model. The cell viability was measured by MTS after pretreated with different doses of EGCG （3.125， 6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 μmol/L）， and the survival rate was calculated. The expression of apoptotic proteins （Bcl-2， Bax） in cardiomyocytes pretreated with different doses of EGCG （100， 200 μmol/L） were detected by Western blotting. Male C57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group， model group and EGCG group （5 mg/g）， with 15 mice in each group. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， while EGCG group was given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. Twelve hours after last medication， myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by anterior descending coronary artery ligation. The area of myocardial infarction was observed by double staining of Evan’s blue and TTC; the percentage of infarction area to cross-sectional area was calculated;SOD activity and MDA content in serum were determined by WST-1 assay; the expression of apoptotic proteins （Bcl-2， Bax） in myocardial tissue were detected by Western blotting， while the phosphorylation levels of signaling pathway related proteins （PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt） were also detected. RESULTS： Cell test results showed that， compared with control group， survival rate and relative expression of Bcl-2 were decreased significantly in model group， while relative expression of Bax was increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， survival rate of cardiomyocyte in 25， 50， 100， 200 μmol/L EGCG groups as well as relative expression of Bcl-2 in 100， 200? μmol/L EGCG groups were increased significantly， while relative expression of Bax in 100， 200 μmol/L EGCG groups were decreased significantly （P<0.05）. Animal experiments showed that no ischemia of myocardial tissue and enlargement of cardiac cavity were observed in sham operation group. Myocardial infarction was observed in model group. Compared with sham operation group， percentage of infarction area to cross-sectional area， the serum content of MDA， the relative expression of Bax in myocardial tissue and p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt were increased significantly in model group， while SOD activity and relative expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， myocardial infarction area of mice in EGCG group was reduced， the percentage of infarction area to cross-sectional area， the serum content of MDA， the relative expression of Bax in myocardial tissue and p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt were significantly decreased， the activity of SOD activity and the relative expression of Bcl-2 were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： EGCG can protect against myocardial ischemia-reperfusion injury， the mechanism of which may be associated with inhibiting the apoptosis of myocardial cells， improving oxidation stress， regulating the expression of apoptotic protein， reducing the phosphorylation level of PI3K/Akt signaling pathway-related proteins.

KEYWORDS? ?Epigallocatechin gallate; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Apoptosis;PI3K/AKT signaling pathway; H9C2 cell; C57BL/6 mice

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌組織壞死。長時間的心肌缺血會導(dǎo)致心肌細胞大量死亡，嚴重影響患者預(yù)后[1]。近年來，隨著溶栓治療、冠狀動脈搭橋以及支架植入術(shù)的發(fā)展，急性心肌梗死患者的病死率明顯降低[2]。然而，冠狀動脈血管再通致缺血再灌注損傷會造成患者心肌細胞受損、心肌梗死面積增大，嚴重影響其遠期預(yù)后和心功能改善。既往研究表明，心肌缺血再灌注損傷的潛在病理機制包括自由基損傷、鈣超載、白細胞激活和微血管損傷等[3-5]。目前，臨床尚無針對冠狀動脈血管再通致缺血再灌注損傷的有效治療方案，因此尋找針對性的有效治療藥物具有重要的臨床意義。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶茶多酚的主要組成成分，是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體。既往已有大量研究表明，該化合物具有抗腫瘤[6]、抗腎損傷[7]、抗衰老[8]、抗炎[9]以及抗心肌缺血再灌注損傷[10]等作用。有研究指出，EGCG是最有效的抗氧化多酚類化合物，可通過有效抑制過氧化氫生成及促進自由基清除等途徑來發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[11];同時，該化合物還可通過抗炎和抗凋亡作用來緩解心肌缺血再灌注損傷[12]。鑒于此，本研究以心肌缺血再灌注損傷模型細胞和模型小鼠為對象，通過Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達情況，以明確EGCG對心肌缺血再灌注損傷致心肌細胞凋亡的體內(nèi)、外抑制作用;同時，通過檢測心肌細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平來初步探討其作用機制，以期為臨床抗心肌缺血再灌注損傷藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Gel DocTMXR+型凝膠成像分析系統(tǒng)、96型水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）;BC175型CO2培養(yǎng)箱（瑞士Salvis Lab公司）;BBS-SDC型超凈臺（博科控股集團有限公司）;DB081型小動物呼吸機（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）;E200型顯微鏡（日本Nikon公司）;MultiskanTM FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;2000CT型超聲細胞破碎儀（上海左樂儀器有限公司）;Centrifuge 5430型高速離心機（艾本德中國有限公司）;EOS 6D數(shù)碼相機（日本Canon公司）。

1.2 藥品與試劑

EGCG原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB1672，純度：95%）;叔丁基過氧化氫（TBHP，美國Sigma公司，批號：416665）;MTS檢測試劑盒以及兔抗小鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab197010、ab59348、ab32503）;兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）單克隆抗體以及山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號分別為#5174、#4249、#4228、#4685、#4060、#7074）;TTC染色試劑、青鏈霉素雙抗、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G3005、P1400、P1200）;超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180624、20180623）;ECL化學(xué)光試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：34095）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0010S）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為11965-084、25200-056、26400044）;伊文思藍染色試劑[金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司，批號：YM-S1647];PDVF膜（美國Millipore公司，批號：IPVH00010）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

H9C2心肌細胞系由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心提供。

1.4 動物

清潔級健康C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量16～18 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)提供，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

2 方法

2.1 細胞試驗

2.1.1 細胞模型構(gòu)建 采用TBHP處理H9C2心肌細胞構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷細胞模型：將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。取對數(shù)生長期的細胞適量，用0.25%胰蛋白酶消化后，以800 r/min離心5 min，收集細胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，以5×104個/mL的密度按2 mL/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）洗滌2次后，加入100 μmol/L TBHP溶液（以完全培養(yǎng)基為溶劑，劑量根據(jù)本研究前期預(yù)試驗確定）500 μL，培養(yǎng)12 h，造成缺氧;隨后換用完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，進行再灌注。

2.1.2 細胞存活率檢測 采用MTS法檢測。取對數(shù)生長期的細胞適量，以2.5×104個/mL的密度按200 μL/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)48 h。將細胞隨機分為對照組、模型組和EGCG不同劑量組（參照本課題組前期預(yù)試驗結(jié)果，劑量分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L），每組設(shè)6個復(fù)孔。吸棄各孔上清液，對照組和模型組加入完全培養(yǎng)基0.5 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基0.5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。除對照組外，其余各組細胞均按“2.1.1”項下方法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型。再灌注3 h后，每孔加入MTS溶液（以DMEM高糖培養(yǎng)基為溶劑）100 μL，培養(yǎng)3 h后，使用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的吸光度值，并計算細胞存活率（細胞存活率=試驗組細胞平均吸光度值/對照組細胞平均吸光度值×100%）。上述試驗重復(fù)3次。

2.1.3 凋亡蛋白表達量檢測 采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的細胞適量，以5×104個/mL的密度按2 mL/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h。將細胞隨機分為對照組、模型組和EGCG低、高劑量組（100、200 μmol/L，劑量設(shè)置參考“2.1.2”項檢測結(jié)果），每組設(shè)3個復(fù)孔。吸取各孔上清液，對照組和模型組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。除對照組外，其余各組細胞均按“2.1.1”項下方法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型。再灌注3 h后，裂解細胞，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST溶液洗膜10 min×3次;加入相應(yīng)一抗[GAPDH的稀釋度為1 ∶ 5 000，Bcl-2、Bax的稀釋度均為1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育過夜;用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育2 h;TBST溶液洗膜10 min×3次，以ECL試劑顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像，并使用 Image Lab 5.2.1軟件分析。Bcl-2、Bax的相對表達量以其與內(nèi)參（GAPDH）條帶的灰度值比值來表示。上述試驗重復(fù)3次。

2.2 動物實驗

2.2.1 分組、造模與給藥 所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組、模型組和EGCG組（5 mg/g，以生理鹽水為溶劑;劑量參照前期預(yù)試驗結(jié)果），每組15只。假手術(shù)組和模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水，EGCG組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥12 h后，采用前降支結(jié)扎法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷小鼠模型：小鼠吸入異氟烷（3 mL/kg）進行麻醉，以仰臥位固定，切開氣管，連接小動物呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率：80次/min，潮氣量：100 mL，呼吸時間比：1 ∶ 1）。采用7/0號縫合線于小鼠左側(cè)第4肋間入胸，并以滑結(jié)結(jié)扎冠狀動脈左前降支，造成缺血30 min;然后解開滑結(jié)，恢復(fù)再灌注4 h，建立心肌缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組用7/0縫合線穿過左前降支而不結(jié)扎，其余操作同上。

2.2.2 心肌梗死面積檢測 采用伊文思藍和TTC雙染色法檢測。取各組小鼠6只，于下腔靜脈注射2%伊文思藍染色試劑0.2 mL后，脫頸處死，剖開胸腔，暴露心臟，當(dāng)心臟右側(cè)變藍時，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗，置于-20 ℃冷凍保存。制備厚約1 mm的心臟切片5片，置于1%TTC染料中，于37 ℃孵育20 min。用相機拍照后，采用Image J 1.52軟件分析[伊文思藍染色的非缺血性心肌呈深藍色，梗死區(qū)（INF）則呈蒼白色;TTC染色后呈淡紅色的活組織被定義為危險區(qū)（AAR）]，并計算同一切面內(nèi)心肌梗死面積占橫截面積百分比（即INF與切片橫截總面積的比值）。

2.2.3 血清指標檢測 取各組余下9只小鼠，均摘除眼球取血，室溫放置1 h后，于4 ℃下以2 000 r/min離心10 min，分離血清。嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，采用WST-1法以酶標儀檢測小鼠血清中SOD的活性及MDA的含量。

2.2.4 心臟組織中凋亡蛋白表達量及通路相關(guān)蛋白磷酸化水平檢測 采用Western blotting法檢測。取“2.2.3”項下各組小鼠心臟組織適量，勻漿，以12 000 r/min離心10 min，超聲（功率：250 W，頻率：25 kHz）粉碎，以12 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)一抗[GAPD的稀釋度為1 ∶ 5 000，其余蛋白的稀釋度均為1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育過夜;用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育2 h;TBST溶液洗膜10 min×3次，以ECL試劑顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像，并使用 Image Lab 5.2.1軟件分析。凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）的相對表達量以其與內(nèi)參（GAPDH）條帶的灰度值比值來表示，PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平以p-PI3K與PI3K、p-Akt與Akt條帶的灰度值比值（即p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值）來表示。上述實驗重復(fù)3次。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞試驗結(jié)果

3.1.1 EGCG對H9C2心肌細胞存活率的影響 與對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，25、50、100、200 μmol/L EGCG組細胞存活率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見表1。本研究選擇100、200 μmol/L作為后續(xù)細胞試驗劑量。

3.1.2 EGCG對H9C2心肌細胞凋亡蛋白表達量的影響 與對照組比較，模型組細胞中Bcl-2的相對表達量顯著降低，Bax的相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，EGCG各劑量組細胞中Bcl-2的相對表達量均顯著升高，Bax的相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見圖1、表2。

3.2 動物實驗結(jié)果

3.2.1 EGCG對模型小鼠心肌梗死面積的影響 假手術(shù)組小鼠心肌組織無缺血表現(xiàn)，心腔未擴大;模型組小鼠心肌組織可見明顯梗死現(xiàn)象，其梗死面積占橫截面積百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;EGCG組小鼠心肌梗死面積明顯減小，其梗死面積占橫截面積百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見圖2（圖中，“ ”表示INF，“ ”表示非缺血性心肌組織）、表3。

3.2.2 EGCG對模型小鼠血清SOD活性以及MDA含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，EGCG組小鼠SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見表3。

3.2.3 EGCG對心肌組織中凋亡蛋白表達量及通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心肌組織中Bax的相對表達量以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均顯著升高，Bcl-2的相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，EGCG組小鼠心肌組織中Bax的相對表達量以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均顯著降低，Bcl-2的相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見圖3、表4。

4 討論

隨著發(fā)病率和致死率的逐年攀升，急性心肌梗死已成為嚴重威脅人們生命安全的疾病之一，該癥的主要治療原則是在心肌梗死發(fā)病的早期對其進行干預(yù)，干預(yù)手段包括藥物溶栓、支架植入和外科搭橋手術(shù)等[13]。但是，對于冠狀動脈血管再通（即心肌缺血再灌注）所導(dǎo)致的損傷，臨床尚無有效的治療方法，嚴重影響了患者的預(yù)后。EGCG作為綠茶茶多酚的主要組成成分，已有大量研究證實其在不同組織缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用：He J等[14]研究表明，EGCG是最有效的抗氧化多酚，可有效抵抗過氧化氫生成，從而發(fā)揮對心肌組織的保護作用;Lv J等[15]研究表明，EGCG可通過抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡來減少腎組織的缺血再灌注損傷;Zhang F等[10]研究表明，EGCG可通過抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。由此可見，EGCG具有一定的抗缺血再灌注損傷的藥理基礎(chǔ)。為此，本研究通過構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷細胞和動物模型，初步考察了EGCG的保護作用及可能機制。

在哺乳動物中，Bcl-2蛋白及其編碼基因在細胞凋亡調(diào)控過程中具有重要作用，其過度表達可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成，從而抑制細胞凋亡[16]。Bax為促凋亡因子，其促凋亡作用與誘導(dǎo)胱天蛋白酶（Caspase）的釋放有關(guān)[17]。由此可見，Bax和Bcl-2蛋白表達的改變可用以評估心肌細胞凋亡水平的變化。PI3K/Akt通路是調(diào)控細胞凋亡的重要信號通路之一，PI3K、Akt蛋白磷酸化水平的升高會上調(diào)心肌細胞中Bax蛋白的表達，同時下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，從而加速心肌缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡[18]。SOD可消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì);而MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一，其可加劇細胞膜損傷，可作為評估脂質(zhì)過氧化程度的重要指標[19]。細胞試驗結(jié)果顯示，模型組細胞存活率和Bcl-2相對表達量均較對照組顯著降低，而Bax的相對表達量則顯著升高，提示細胞受到缺血再灌注損傷，并出現(xiàn)凋亡。與模型組比較，5、50、100、200 μmol/L EGCG組細胞存活率以及100、200 μmol/L EGCG組細胞中Bcl-2的相對表達量均顯著升高，而100、200 μmol/L EGCG組細胞中Bax的相對表達量均顯著降低，提示EGCG可抑制心肌缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的細胞凋亡，且這種作用與調(diào)控凋亡蛋白的表達有關(guān)。結(jié)合體外試驗結(jié)果，本研究以心肌缺血再灌注損傷模型小鼠為對象，進一步考察了EGCG對其心肌細胞的保護作用及可能機制。結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠未見心肌組織缺血及心腔擴大等現(xiàn)象;模型組小鼠可見明顯的心肌梗死現(xiàn)象，其心肌梗死面積占橫截面積百分比、血清MDA含量、心肌組織中Bax相對表達量以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均顯著升高，血清SOD活性和心肌組織中Bcl-2的相對表達量均顯著降低，提示發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時，小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平、凋亡蛋白及PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達均受到明顯影響，模型復(fù)制成功。與模型組比較，EGCG組小鼠心肌梗死面積有所減小，其梗死面積占橫截面積百分比、血清MDA含量、心肌組織中Bax相對表達量以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值均顯著降低，血清SOD活性和心肌組織中Bcl-2的相對表達量均顯著升高，提示EGCG可通過改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)控凋亡蛋白表達、降低PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平等途徑來發(fā)揮對模型小鼠的保護作用。

綜上所述，EGCG對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，這種作用可能與抑制心肌細胞凋亡、改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)控凋亡蛋白表達、降低PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平有關(guān)。但本研究體內(nèi)實驗只設(shè)置了單一劑量組，且并未設(shè)置PI3K/Akt通路激動劑或抑制劑作為對照，故所得結(jié)論尚有待后續(xù)研究予以確證。

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（收稿日期：2019-02-28 修回日期：2019-06-17）

（編輯：張元媛）