劉帆　張穎穎　侯林

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2221-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.12

摘 要 目的：評價安兒寧顆粒的體外抗菌、抗炎和免疫增強(qiáng)活性。方法：采用微量稀釋法檢測安兒寧顆粒（1.562 5～100 mg/mL）對10種臨床常見致病菌的抑制作用并計算其最低抑菌濃度（MIC）;以RAW 264.7細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞）為對象，采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)建立細(xì)胞炎癥模型，以MTT法考察安兒寧顆粒（0.312 5～20 mg/mL）對細(xì)胞增殖及其釋放一氧化氮（NO）的影響;以BALB/c小鼠脾臟淋巴細(xì)胞為對象，以MTT法考察安兒寧顆粒（0.312 5～20 mg/mL）對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：安兒寧顆粒對表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的MIC均為6.25 mg/mL，對變形桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）的MIC均為12.5 mg/mL，對銅綠假單胞菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC均為25 mg/mL，對大腸埃希菌（臨床分離菌株）、傷寒沙門菌的MIC均為50 mg/mL。與LPS模型組比較，安兒寧顆粒在0.312 5～1.25 mg/mL的劑量下能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO的釋放（P<0.05）;與空白對照組比較，安兒寧顆粒在試驗劑量下對RAW 264.7細(xì)胞和小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖無干擾或有促增殖趨勢，其在0.625、0.312 5 mg/mL劑量下能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖（P<0.05）。結(jié)論：安兒寧顆粒在體外對臨床常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌均有一定的抑制作用，并具有抗炎和免疫增強(qiáng)作用。

關(guān)鍵詞 安兒寧顆粒;抗菌;抗炎;免疫活性

Study on in vitro Antibacterial，Anti-inflammatory and Immunopotentiating Activity of An’erning Granules

LIU Fan1，2，ZHANG Yingying1，HOU Lin1，2（1. College of Pharmacy， Shandong University of TCM， Jinan 250355， China; 2. Qingdao Academy of Chinese Medical Sciences， Shandong University of TCM， Shandong Qingdao 266114， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To evaluate the in vitro antibacterial， anti-inflammatory and immunopotentiating activity of An’erning granules. METHODS： Micro-dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of An’erning granules （1.562 5-100 mg/mL） on 10 kinds of common pathogenic bacteria. Using RAW 264.7 cells （mono-nuclear macrophage） as objects， LPS was used to replicate inflammation model. MTT assay was used to investigate the effects of An’erning granules （0.312 5-20 mg/mL） on proliferation and the release of NO of macrophage. Using spleen lymphocyte of BALB/c mice as objects， MTT assay was used to investigate the effects of An’erning granules （0.312 5-20 mg/mL） on lymphocyte proliferation. RESULTS： MIC of An’erning granules to Epidermis staphylococcus and Streptococcus pneumoniae was 6.25 mg/mL; MIC of An’erning granules to Proteus vulgaris， Klebsiella pneumoniae， Bacillus subtilis and Escherichia coli （standard strain） were 12.5 mg/mL; MIC of An’erning granules to Pseudomonas aeruginosa， Enterococcus faecalis and Bacillus cereus were 25 mg/mL; MIC of An’erning granules to E. coli （clinical isolates） and Salmonella typhia were 50 mg/mL. Compared with LPS model group， An’erning granules could significantly reduce the LPS-induced release of NO in RAW 264.7 cells at the dose of 0.312 5-1.25 mg/mL （P<0.05）. Compared with blank control group， An’erning granule had no interference on the proliferation of RAW 264.7 cells and spleen lymphocytes of mice or had a tendency to promote proliferation. It could significantly promote lymphocyte proliferation at doses of 0.625 and 0.312 5 mg/mL （P<0.05）. CONCLUSIONS： An’erning granules not only have certain in vitro inhibitory effects on clinical common Gram-positive and Gram-negative pathogenic bacteria， but also have anti-inflammatory and immunization enhancement effects.

KEYWORDS? ?An’erning granule;Antibacterial;Anti-inflammatory;Immune activity

呼吸道感染疾病是主要由細(xì)菌、病毒及少數(shù)支原體、衣原體等病原體感染引起的常見疾病，在兒童中發(fā)病率最高，而抗菌、抗炎是其主要治療手段之一[1]。但化學(xué)類抗菌藥物在治療感染性疾病的同時也常常引起患者體內(nèi)菌群失調(diào)，加之其不合理使用導(dǎo)致的耐藥性逐年增加[2]，使得尋找其他安全、有效的藥物用于治療呼吸道感染疾病具有重要的臨床意義。

扶正祛邪類中藥能通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，在治療感染性疾病尤其是呼吸道感染方面優(yōu)勢顯著[3]。安兒寧顆粒處方源于藏醫(yī)經(jīng)典方“九西更卓”，至今已有300年應(yīng)用史;該藥由天竺黃、人工牛黃、紅花、巖白菜、唐古特烏頭、高山辣根菜、甘草、洪連和檀香等9味藥材組方精制而成，具有清熱祛風(fēng)、止咳化痰的功效，主要用于治療小兒風(fēng)熱感冒、咽痛發(fā)熱、咳嗽有痰、上呼吸道感染見上述證候者[4]。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，安兒寧顆粒不僅可用于治療小兒上呼吸道感染，還可用于治療小兒急性支氣管炎、支氣管肺炎等下呼吸道感染疾病，對以上疾病引起的發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咽痛等癥狀也有較好的治療作用[5]。藥效學(xué)研究證實，安兒寧顆粒有較好的鎮(zhèn)咳祛痰、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎作用[6]，且處方中的紅花、甘草也已明確具有抗菌、抗炎及增強(qiáng)免疫作用[7]。為明確安兒寧顆?？咕?、抗炎和增強(qiáng)免疫的作用，本研究作為“安兒寧顆粒二次開發(fā)”課題的一部分，就該顆粒劑對常見呼吸道感染致病菌、脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用以及對脾臟細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行考察，為該顆粒劑臨床用藥適應(yīng)證范圍的拓寬、進(jìn)一步深入開發(fā)及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平公司）;CKX-31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Finnpipette公司）;TD5Z型酶標(biāo)板離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）;LH-SDS型超凈工作臺（濟(jì)南隆宏凈化設(shè)備有限公司）;HF90型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）;MJ37600型全自動高壓滅菌鍋（山東德強(qiáng)儀器有限公司）;DW-86L286型低溫儲物箱（海爾電器有限公司）;101A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市試驗儀器總廠）;LRH -250A型生化培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠）;Vortex3型渦旋振蕩器（德國IKA公司）;SZH-82型氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市城東久久實驗儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

安兒寧顆粒（批號：02170612）由金訶藏藥股份有限公司提供。處方組成：天竺黃66.7 g、人工牛黃5.3 g、甘草53.3 g、洪連66.7 g、唐古特烏頭66.7 g、紅花53.3 g、巖白菜53.3 g、高山辣根菜53.3 g、檀香66.7 g。提取及制備工藝：取檀香、紅花提取揮發(fā)油（另器收集），殘渣與天竺黃、甘草、洪連、唐古特烏頭、巖白菜、高山辣根菜等6味藥材混合，加入10倍量水（mL/g）煎煮2次（分別煎煮3、2 h），合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.30～1.35（50 ℃）的稠膏;取稠膏加入人工牛黃和蔗糖（輔料）適量，制粒，干燥;加入檀香、紅花揮發(fā)油混勻，制成1 000 g，即得。以甘草酸的含量為指標(biāo)進(jìn)行成分轉(zhuǎn)移監(jiān)測，每1 g干浸膏粉相當(dāng)于安兒寧顆粒13.68 g，相當(dāng)于生藥材6.57 g。因輔料蔗糖可導(dǎo)致抗菌試驗產(chǎn)生假陽性結(jié)果，故本研究以安兒寧顆粒未加蔗糖前的干浸膏粉（即稠膏在鼓風(fēng)干燥箱中干燥后獲得）添加人工牛黃和檀香、紅花揮發(fā)油制成不含蔗糖的安兒寧顆粒樣品，用于后續(xù)試驗。

LPS（美國 Sigma 公司，批號：S11060）;硫酸慶大霉素注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37021973，規(guī)格：2 mL/支）;2%RPMI 1640細(xì)胞維持液[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號：61870-036];MH（B）肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20151206001）;紅細(xì)胞裂解液（美國Hyclone公司，批號：00-4333-57）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;青霉素、鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）;pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，無菌級別）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Gibco公司）;二甲基亞砜（DMSO，天津化學(xué)試劑廠）;噻唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司）;生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）;水為蒸餾水。

1.3 菌株及細(xì)胞株

革蘭氏陽性菌：肺炎鏈球菌CMCC（B）31001，大腸埃希菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）CMCC（B）44102，枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501，蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63301，傷寒沙門菌CMCC（B）50071，糞腸球菌ATCC 35667，大腸埃希菌（臨床分離菌株）D1812;革蘭氏陰性菌：表皮葡萄球菌ATCC 12228，銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，變形桿菌CMCC（B）49027，肺炎克雷伯菌CMCC（B）46117。以上菌株均由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供。

RAW 264.7細(xì)胞株（單核巨噬細(xì)胞）由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物室提供。

1.4 動物

BALB/c小鼠，SPF級，雄雌各半，體質(zhì)量（20±2）g，由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20140007。

2 方法

2.1 安兒寧顆粒的體外抑菌試驗

參考文獻(xiàn)[8]，采用微量稀釋法進(jìn)行試驗。取“1.2”項下不含蔗糖的安兒寧顆粒樣品，以生理鹽水配制成100 mg/mL的藥液，以一次性無菌0.22 μm微孔過濾器濾去雜質(zhì)和細(xì)菌，備用。在96孔板每行的第1～8孔分別加入液體細(xì)菌培養(yǎng)基[MH（B）肉湯粉21 g，加入1 000 mL水中加熱攪拌至溶解，121 ℃滅菌20 min，即得]100 μL;在第1孔中加入100 mg/mL的安兒寧顆粒藥液100 μL，從第2～6孔依次對半稀釋至最低質(zhì)量濃度1.562 5 mg/mL，作為不同給藥劑量組（劑量根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法制定）;在第7孔中加入質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的慶大霉素藥液（生理鹽水配制）10 μL，作為陽性對照組;然后在每行的第1～8孔中均分別加入“1.3”項下11種菌株（其中大腸埃希菌有2種來源菌株）的菌液（1×106CFU/mL，均以液體細(xì)菌培養(yǎng)基配制）10 μL，第8孔作為陰性對照組;同時設(shè)置不含菌、只加入液體細(xì)菌培養(yǎng)基的空白對照組。將96孔板在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長狀況。每種細(xì)菌的每個濃度均設(shè)置3個復(fù)孔。

2.2 安兒寧顆粒的體外抗炎活性試驗

2.2.1 安兒寧顆粒對巨噬細(xì)胞增殖的影響 參照文獻(xiàn)[9-10]方法進(jìn)行試驗。取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞，用10% RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個/mL，按每孔100 μL加入96孔板，然后每孔加入質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL的安兒寧顆粒藥液（取“1.2”項下不含蔗糖的安兒寧顆粒樣品，以2%RPMI 1640維持液配制）100 μL，作為不同給藥劑量組（劑量根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]方法和預(yù)試驗結(jié)果制定）;同時設(shè)置加入等體積2% RPMI 1640維持液的空白對照組。將96孔板在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液（以PBS配制）20 μL，繼續(xù)按上述條件培養(yǎng)4 h;棄去上清液，每孔加DMSO 150 μL，于37 ℃條件下采用酶標(biāo)儀震蕩10 min后，在492 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，用以表示存活細(xì)胞數(shù)。每組均設(shè)置3個復(fù)孔。

2.2.2 安兒寧顆粒對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）的影響 參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行試驗。取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞，按“2.2.1”項下方法設(shè)置安兒寧顆粒20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg/mL劑量組并加入相應(yīng)藥液;另設(shè)空白對照組和LPS模型組，均分別加入等體積2% RPMI 1640維持液;除空白對照組外，各給藥劑量組和LPS模型組細(xì)胞均加入LPS溶液（以生理鹽水配制，終質(zhì)量濃度均為2 μg/mL）。將96孔板在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，以Griess法[12]測定上清液OD值。以O(shè)D值為橫坐標(biāo)（x）、細(xì)胞中的亞硝酸根離子含量（NO2-）為縱坐標(biāo)（y），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=45.685x2+115.82x-5.112 8（r=0.999 8）。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各組細(xì)胞上清液中NO2-的含量，用以間接表示細(xì)胞釋放的NO含量。按公式計算NO釋放抑制率：抑制率（%）=[1-（給藥組NO含量-空白對照組NO含量）/（模型組NO含量-空白對照組NO含量）]×100%。每組均設(shè)置3個復(fù)孔。

2.3 安兒寧顆粒的體外免疫活性試驗

參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行試驗。

2.3.1 小鼠淋巴細(xì)胞的制備 取BALB/c小鼠，斷頸脫臼處死后放入75%乙醇中浸泡2～3 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上，在無菌條件下切開其腹腔，剪去與脾臟相連的組織，取下脾臟，用鈍頭鑷子在滅菌后的200目鋼絲網(wǎng)上磨碎，用無菌PBS 2 mL沖洗。將含脾臟細(xì)胞的PBS沖洗液以800 r/min離心10 min;棄去上清液，向離心管中加入紅細(xì)胞裂解液200 μL，于冰上放置13 min，以渦旋震蕩儀輕輕渦旋2次，再以800 r/min離心5 min;棄去上清液，加入紅細(xì)胞裂解液100 μL，再以800 r/min離心5 min;棄去上清液，將細(xì)胞以10%RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，計數(shù)并稀釋至密度為1.5×106個/mL，備用。

2.3.2 安兒寧顆粒對小鼠淋巴細(xì)胞的影響 取“2.3.1”項下的脾臟淋巴細(xì)胞重懸液，用10%RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至密度為1.0×105個/mL，按每孔100 μL加入96孔板，按“2.2.1”項下方法設(shè)置安兒寧顆粒不同給藥劑量組并加入相應(yīng)藥液;同時設(shè)置加入等體積2% RPMI 1640維持液的空白對照組。將96孔板在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)44 h后，按“2.2.1”項下“每孔加入5 mg/mL的MTT溶液（以PBS配制）……用以表示存活細(xì)胞數(shù)”步驟同法操作。每組均設(shè)置3個復(fù)孔。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 安兒寧顆粒的體外抗菌活性

肉眼觀察結(jié)果顯示，陰性對照組孔培養(yǎng)基渾濁、細(xì)菌生長良好，陽性對照組孔培養(yǎng)基澄清、細(xì)菌生長不明顯，空白對照組孔培養(yǎng)基澄清、細(xì)菌生長不明顯，提示安兒寧顆粒對11種細(xì)菌均有抑制作用。安兒寧顆粒對傷寒沙門菌和大腸埃希菌（臨床分離菌株）的最低抑菌濃度（MIC）為50 mg/mL，對糞腸球菌和蠟樣芽孢桿菌的MIC為25 mg/mL，對變形桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）、肺炎克雷伯菌和枯草芽孢桿菌的MIC為12.5 mg/mL，對表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的MIC為6.25 mg/mL。安兒寧顆粒的體外抑菌活性檢測結(jié)果見表1。

3.2 安兒寧顆粒的體外抗炎活性

3.2.1 安兒寧顆粒對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組比較，安兒寧顆粒0.312 5、1.25 mg/mL劑量組細(xì)胞OD值未明顯降低，表明此劑量對細(xì)胞無毒性;0.625 mg/mL劑量組OD值有一定升高，表明此劑量有促進(jìn)細(xì)胞增殖的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。安兒寧顆粒對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響考察結(jié)果見表2（注：當(dāng)安兒寧顆粒劑量≥2.5 mg/mL時，藥液顏色較深，干擾試驗結(jié)果，略去）。

3.2.2 安兒寧顆粒對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響 與空白對照組比較，LPS模型組細(xì)胞中NO含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明炎癥模型成功建立;與模型組比較，安兒寧顆粒0.312 5～1.25 mg/mL劑量組細(xì)胞中NO含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明上述劑量安兒寧顆粒均能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO，且NO釋放抑制率呈劑量依賴趨勢，提示其抗炎效果良好。安兒寧顆粒對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響考察結(jié)果見表3。

3.3 安兒寧顆粒的體外免疫活性

與空白對照組比較，安兒寧顆粒0.312 5、0.625 mg/mL劑量組細(xì)胞OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并呈劑量依賴趨勢，表明此劑量能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。安兒寧顆粒對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響考察結(jié)果見表2（注：當(dāng)安兒寧顆粒劑量≥2.5 mg/mL時，藥液顏色較深，干擾試驗結(jié)果，略去）。

4 討論

表皮葡萄球菌滋生于人體的皮膚和陰道等，是導(dǎo)致醫(yī)院交叉感染的主要細(xì)菌之一[14-15]。肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌均存在于呼吸道，可引起支氣管炎、大葉性肺炎和腦膜炎等疾病，其中前者為革蘭氏陽性球菌，對青霉素類抗生素的耐藥現(xiàn)象目前極少，而后者為革蘭氏陰性球菌，存在于呼吸道和腸道，其感染致死率較高[16]。糞腸球菌、大腸埃希菌和變形桿菌均可引起消化道感染，誘發(fā)各種疾病[17]?？莶菅挎邨U菌、蠟樣芽孢桿菌及傷寒沙門菌易污染食物產(chǎn)生腸毒素，并導(dǎo)致食物中毒[18]。銅綠假單胞菌感染易引起敗血癥和菌血癥，且具有高度耐藥性，在燒傷后感染可能導(dǎo)致患者死亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，安兒寧顆粒對上述多種臨床常見細(xì)菌均具有一定抑制作用，表現(xiàn)出較好的廣譜抗菌效果;根據(jù)MIC值結(jié)果可知，其對表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌具有相對較強(qiáng)的抑制作用，對大腸埃希菌（臨床分離菌株）和傷寒沙門菌的抑制作用較弱。該顆粒劑的體內(nèi)抗菌效果有待于進(jìn)一步研究。

巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，能對機(jī)體起到免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)和抗原呈遞等作用，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[20]。活化后的巨噬細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞均有殺滅作用，可通過釋放NO、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6、IL-12等因子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，殺滅病原體[21]。巨噬細(xì)胞主要通過釋放NO發(fā)揮抗病原生物、殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等作用：一方面，巨噬細(xì)胞能通過分泌NO，提高對各種病原體殺滅的效率;另一方面，其產(chǎn)生的過量NO可促進(jìn)炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)炎癥因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等的釋放，從而啟動炎癥反應(yīng)[9]。當(dāng)巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)活化后，會合成并釋放大量炎癥因子如NO，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對組織器官造成損傷[21]。因此，可采用LPS建立巨噬細(xì)胞炎癥模型，并根據(jù)藥物降低巨噬細(xì)胞中NO釋放量的程度來反映藥物的抗炎活性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，安兒寧顆粒在0.312 5～1.25 mg/mL的劑量下對細(xì)胞中NO釋放的抑制率達(dá)46.29%～97.39%，表明其能抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，具有一定的體外抗炎活性。

脾臟是哺乳動物最重要的外周免疫器官，脾細(xì)胞中含有約40%T淋巴細(xì)胞和60%B淋巴細(xì)胞，是機(jī)體應(yīng)對外界抗原入侵、進(jìn)行免疫反應(yīng)、產(chǎn)生相應(yīng)抗體的重要器官，其主要參與體液免疫，在細(xì)胞免疫中也具有重要的作用[22]。有些免疫細(xì)胞激活物如LPS在體內(nèi)外均可刺激脾臟中的B淋巴細(xì)胞增殖分化，刀豆蛋白或植物血凝素等在體內(nèi)外可刺激脾臟中T淋巴細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，因此脾臟細(xì)胞的增殖情況可直接反映機(jī)體的免疫狀態(tài)[23]。本研究結(jié)果顯示，安兒寧顆粒在0.625、0.312 5 mg/mL的劑量下作用于脾臟細(xì)胞后的OD值較空白對照組明顯增高，表明該顆粒劑在一定劑量下可促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，提示其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用。

綜上所述，安兒寧顆粒在體外對臨床常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌均有一定的抑制作用，并具有抗炎和增強(qiáng)免疫的作用，在感染性疾病的治療方面具有較好的前景，尚待進(jìn)一步深入研究開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 佟德恩.急診治療上呼吸道感染臨床用藥分析[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2013，10（23）：10-11.

[ 2 ] 王兆霞.抗生素的使用情況調(diào)查及細(xì)菌耐藥性分析[J].北方藥學(xué)，2018，15（3）：191.

[ 3 ] 許玲，呂書勤.扶正祛邪中藥對急性呼吸窘迫綜合征模型大鼠影響研究[J].實用中醫(yī)藥雜志，2009，25（3）：141- 142.

[ 4 ] 劉憲勇，付加雷，王麗娥，等.安兒寧顆粒治療小兒上呼吸道感染108例療效觀察[J].山東醫(yī)藥，2009，49（15）：79.

[ 5 ] 王海蘋.安兒寧顆粒藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2014，12（3）：160-161.

[ 6 ] 宋艷芹，杜源，孫雪，等.安兒寧顆粒解熱抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（32）：1300-1302.

[ 7 ] 扈曉佳，殷莎，袁婷婷，等.紅花的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實踐雜志，2013，31（3）：161-169.

[ 8 ] 王新紅，殷麗，魏娟，等.西吡氯銨漱口液對銅綠假單胞菌和MRSA的抗菌活性研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（9）：1389-1391.

[ 9 ] 孟慶然.酸漿宿萼總皂苷對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10] 房雷雷，趙肖通，張彥青，等.姬松茸多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的機(jī)制[J].食品與機(jī)械，2018，34（5）：16-19.

[11] 劉鵬飛，朱偉，萬進(jìn)，等.人參多糖對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子生成的抑制作用及其機(jī)制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，24（14）：102-107.

[12] 于紅紅，吳瑪莉，張智偉，等.黃連解毒湯含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子影響研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（14）：11-13.

[13] 張艷.溪黃草提取物的免疫活性篩選及其有效單體成分的免疫抑制機(jī)理研究[D].上海：華東理工大學(xué)，2006.

[14] 曹曉光.臨床分離表皮葡萄球菌的耐藥性分析及與icaD基因表達(dá)關(guān)系的研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2012.

[15] 席曉霞.初生嬰兒腸道菌群與母體各部位菌群相關(guān)性研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[16] HAQUE NZ，ZUNIGA LC，PEYRANI P，et al. Relationship of vancomycin minimum inhibitory concentration to mortality in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureushospital-acquired，ventilator-associated，or health-care-associated pneumonia[J]. Chest，2010，138（6）：1356-1362.

[17] 劉百祥，黃旭，賓琳，等.試管中椒艾合劑對常見腸道感染菌的抑制作用[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，12（3）：9-10、21.

[18] 張穎穎，付業(yè)佩，王萍.羅勒多糖抗菌作用研究[J].山東化工，2017，46（20）：6-7.

[19] 王文晶，黃茂，趙旺勝，等.下呼吸道感染銅綠假單胞菌流行和耐藥現(xiàn)狀分析[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2006，10（3）：33-36.

[20] MULLINS DW，WALKER TM，BURGER CJ，et al.Taxo-lmediated changes in fibrosarcoma-induced immune cell function：modulation of antitumor activities[J]. Cancer Immunol Immunother，1997，45（1）：20-28.

[21] 李敏，劉耕陶.雙環(huán)醇對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)和NF-kB活化的抑制作用[J].中國藥理學(xué)通報，2006，22（12）：1438-1443.

[22] 陳星星，李焰，楊小燕，等.鐵皮石斛對免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2018，54（4）：100-103.

[23] 林志.藥物免疫毒性評價關(guān)鍵技術(shù)的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

（收稿日期：2018-12-28 修回日期：2019-07-02）

（編輯：段思怡）