李翔 覃艮艷 彭俊 歐陽云 蔣鵬飛 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察密蒙花顆粒劑對(duì)去勢(shì)雄兔淚腺組織細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表達(dá)的影響。方法 將30只新西蘭長耳白兔隨機(jī)分為5組，分別為空白組（不灌胃）、模型組（不灌胃）、密蒙花顆粒劑組（灌胃藥物為密蒙花顆粒劑）、安慰劑組（灌胃藥物為生理鹽水）、睪酮組（在兔大腿肌肉處注射丙酸睪酮注射液）。除空白組外，所有兔子的造模方式均為雙側(cè)睪丸及附睪切除術(shù)。干預(yù)30 d后，將所有兔子處死，摘取淚腺組織進(jìn)行免疫組化染色觀察淚腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)并檢測(cè)淚腺組織中Caspase-1和IL-18的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化染色顯示：模型組兔子淚腺組織排列不整齊，細(xì)胞破碎;密蒙花顆粒劑組與睪酮組兔子淚腺組織排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。與空白組相比，模型組Caspase-1、IL-18平均光密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，安慰劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;密蒙花顆粒劑組與睪酮組Caspase-1、IL-18平均光密度值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與睪酮組相比，密蒙花顆粒劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 密蒙花顆粒劑對(duì)去勢(shì)雄兔淚腺細(xì)胞Caspase-1、IL-18表達(dá)具有抑制作用，密蒙花顆粒劑可能通過抑制淚腺組織中Caspase-1、IL-18的表達(dá)，減少淚腺組織細(xì)胞的焦亡，從而達(dá)到治療干眼的目的。

〔關(guān)鍵詞〕 密蒙花顆粒劑;去勢(shì)雄兔;淚腺組織;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1;白細(xì)胞介素-18

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ?; 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Mimenghua Granules on the expression of cysteine aspartic protease-1 （Caspase-1） and interleukin-18 （IL-18） in cells from lacrimal gland tissue of castrated male rabbits. Methods A total of 30 New Zealand long-eared white rabbits were randomly divided into 5 groups： a blank group （no gavage）， a model group （no gavage）， Mimenghua Granules group （Mimenghua Granules as the gavage drugs）， a placebo group （saline as the gavage drugs）， a testosterone group （testosterone propionate injection was injected into the rabbit thigh muscle）. Except for the blank group， all rabbits were subjected to bilateral testicular and epididymal resection for molding. After 30 days of intervention， all rabbits were sacrificed， and lacrimal gland tissue was harvested for immunohistochemical staining to observe the structure of lacrimal gland tissue. And the expression of 2 pyroptosis factors of Caspase-1 and IL-18 in lacrimal gland tissue was detected. Results Immunohistochemistry staining showed that the lacrimal gland tissue of the model group was not arranged neatly and the cells were broken; the lacrimal gland tissue of the Mimenghua Granules group and the testosterone group were arranged neatly and the cell structure was clear. Compared with the blank group， the difference of average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the model group was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， there was no statistically significant difference in the average optical of Caspase-1 and IL-18 in the placebo group （P>0.05）; while the differences in average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the Mimenghua Granules group and the testosterone group were statistically significant （P<0.05）. Compared with the testosterone group， the difference of average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the Mimenghua Granules group was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Mimenghua Granules has an inhibitory effect on the expression of Caspase-1 and IL-18 in castrated male rabbits' lacrimal gland cells. Mimenghua Granules may reduce the pyroptosis of lacrimal gland tissue through inhibiting the expression of Caspase-1 and IL-18 in lacrimal gland tissue to achieve the purpose of treating dry eyes.

〔Keywords〕 Mimenghua Granules; castrated male rabbits; lacrimal gland tissue; Caspase-1; IL-18

淚膜與眼表協(xié)會(huì)（tear film and ocular surface society，TFOS）在干眼病國際專家共識(shí)第二版（dry eye workshop Ⅱ， DWESⅡ）中對(duì)干眼進(jìn)行了重新定義，干眼不僅是淚液和眼球表面的多因素疾病，還可引起主觀不適、視覺障礙和淚膜不穩(wěn)定等多種癥狀[1]。干眼全球平均發(fā)病率為14%～33%，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)[2-3]。因此受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，成為眼科的研究熱點(diǎn)。干眼的發(fā)病機(jī)制有多種，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干眼的發(fā)生與雄激素水平降低有關(guān)，對(duì)雄兔進(jìn)行去勢(shì)干預(yù)后可造成干眼模型[4]，此外，干眼還與免疫、炎性反應(yīng)、淚腺細(xì)胞程序化死亡等因素關(guān)系密切，而淚腺細(xì)胞的程序化死亡在干眼的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要作用[5-6]。焦亡是細(xì)胞程序化死亡方式的一種，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）是細(xì)胞焦亡因子信號(hào)通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本研究以去勢(shì)雄兔為研究對(duì)象，通過觀察密蒙花顆粒劑對(duì)去勢(shì)雄兔淚腺組織結(jié)構(gòu)及焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、IL-18表達(dá)的影響，探討其治療干眼的部分作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭長耳白兔（雄性）30只，體質(zhì)量 為1.5～2.0 kg（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012）。飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 ?主要儀器

裂隙燈顯微鏡、手持式直接檢眼鏡，均購自蘇州六六視覺科技股份有限公司;Leica石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）;顯微攝像機(jī)（上海萬衡精密光學(xué)儀器廠）;Image Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)。以上實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)器材均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和眼科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 ?主要藥品與試劑

密蒙花顆粒劑（按密蒙花∶枸杞∶菊花=1∶1∶1質(zhì)量比組成，湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑教研室按現(xiàn)代制劑工藝制備）;丙酸睪酮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1507111，規(guī)格：1 mL∶25 mg）;注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào)：170943，規(guī)格：40萬單位）;氯化鈉注射液（江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：18111304，規(guī)格：500 mL∶4.5 g）;滅菌注射用水（上海長征富民金山制藥有限公司，批號(hào)：201809180，規(guī)格：500 mL）;Harris蘇木素（湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：E607317）;兔抗兔Caspase-1單克隆抗體（規(guī)格：200 μg/mL）、兔抗兔IL-18單克隆抗體（規(guī)格：200 μg/mL）、免疫組織化學(xué)試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 ?分組及造模

將30只成年新西蘭長耳白兔通過隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組6只，分別為：空白組、模型組、密蒙花顆粒劑組、安慰劑組、睪酮組。除空白組外，所有兔子的造模方式均為切除雙側(cè)睪丸及附睪[7]。

2.2 ?干預(yù)及療程

造模成功后，在第二天對(duì)各組兔子進(jìn)行干預(yù)，具體的的干預(yù)方式為：空白組、模型組不灌胃;密蒙花顆粒劑組、安慰劑組從術(shù)后第3天開始進(jìn)行灌胃，灌胃時(shí)間為30 d，按100 mg/kg灌胃，每日灌胃3次，密蒙花顆粒劑組灌胃藥物為密蒙花顆粒劑，安慰劑組為生理鹽水;睪酮組按0.5 mL/kg在兔大腿肌肉處注射丙酸睪酮注射液，每3天注射1次。療程均為30 d。

2.3 ?取材方法

灌胃結(jié)束后第1天取材。所有兔子采用空氣栓塞法處死，摘取雙眼淚腺組織，將標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行石蠟包埋及切片，備行免疫組化檢測(cè)。

2.4 ?免疫組化檢測(cè)

將所摘取淚腺組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，具體步驟為：石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后切片，3% H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶，根據(jù)需要對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理，滴加兔來源的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，2 min×3次，選用DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┻M(jìn)行封片。在高倍顯微鏡下觀察各組淚腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，光鏡400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，測(cè)定Caspase-1、IL-18的平均光密度值。

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組兔子淚腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)

免疫組化染色顯示空白組淚腺組織排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰;模型組淚腺組織排列不整齊，組織結(jié)構(gòu)大片變性;密蒙花顆粒劑組淚腺組織排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰;安慰劑組淚腺組織排列不整齊，組織結(jié)構(gòu)不清晰;睪酮組淚腺組織排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰。見圖1。

3.2 ?各組兔子淚腺組織中Caspase-1、IL-18的平均光密度值

與空白組相比，模型組Caspase-1、IL-18平均光密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，安慰劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;密蒙花顆粒劑組和睪酮組Caspase-1、IL-18平均光密度值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與睪酮組相比，密蒙花顆粒劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

4 討論

干眼的發(fā)病機(jī)制涉及許多細(xì)胞和分子過程[8-10]，包括炎性細(xì)胞因子增加、金屬蛋白酶高表達(dá)及淚液滲透壓改變等。Suzanne Hagan等[11]認(rèn)為干眼是以慢性炎癥為特征的衰弱性病癥，盡管干眼最初的眼表損傷可能是多因素的（淚液量少、淚液質(zhì)量差、使用隱形眼鏡等），但在大多數(shù)情況下，慢性疾病進(jìn)展的惡性循環(huán)似乎相似——先天性免疫通路被激活，隨后觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，如T細(xì)胞激活、一些細(xì)胞因子的釋放等，最終導(dǎo)致淚腺細(xì)胞損傷、淚液分泌不足，淚液分泌系統(tǒng)障礙又可降低淚膜的穩(wěn)定性，形成惡性循環(huán)。淚腺功能喪失導(dǎo)致淚膜完整性被破壞，這是干眼主要的致病機(jī)制之一，淚膜功能障礙的主要原因在于淚液黏蛋白和脂質(zhì)成分的改變，雄激素缺乏是淚液成分改變的促進(jìn)因素[12]。

彭清華教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合干眼的發(fā)病機(jī)制，創(chuàng)制了密蒙花顆粒劑，密蒙花味甘，性微寒，入肝經(jīng)，具有清熱瀉火養(yǎng)肝、明目退翳之功效，《本草經(jīng)疏》中有：“密蒙花觀《本經(jīng)》所主，無非肝虛有熱所致。蓋肝開竅于目，目得血而能視，肝血虛則為青盲膚翳，肝熱甚，則為赤腫、眵淚赤脈，及小兒痘瘡余毒，疳氣攻眼。此藥甘以補(bǔ)血，寒以除熱，肝血足而諸證無不愈矣?！爆F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)密蒙花中的黃酮類物質(zhì)具有擬雄激素的作用[13-14]，如蒙花苷、醉魚草苷、刺槐素等，發(fā)揮的擬雄激素作用可以抑制淚腺組織炎癥反應(yīng)，降低淚腺細(xì)胞死亡率，提高基礎(chǔ)淚液分泌與淚膜破裂時(shí)間[15-16]，從而治療干眼，前期臨床研究證實(shí)其對(duì)干眼治療有效。

淚液的高滲透壓改變了眼表的物理環(huán)境，可引起角膜上皮細(xì)胞做出相應(yīng)的改變，氧化的線粒體DNA激活Caspase-1，活化的Caspase-1將IL-18切割為活性形式，最終導(dǎo)致淚腺中IL-18大量表達(dá)[17]，這是干眼的一個(gè)重要病因[18]?；罨腃aspase-1還可增加間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上IL-6及細(xì)胞黏附分子的水平，而IL-6在干眼中的作用已被實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)在干眼患者淚液中有Caspase-1高表達(dá)[21]，使用Caspase-1抑制劑可緩解干眼患者的癥狀[22]，證明Caspase-1在干眼的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)以新西蘭去勢(shì)雄兔為研究對(duì)象，在密蒙花顆粒劑組經(jīng)過30 d灌胃后，去勢(shì)雄兔淚腺組織排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰，焦亡因子Caspase-1、IL-18的平均光密度值低于模型組，與睪酮組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明密蒙花顆粒劑能抑制Caspase-1、IL-18表達(dá)，改善干眼癥狀，與雄激素的作用相當(dāng)。

本研究發(fā)現(xiàn)密蒙花顆粒劑能抑制雄激素缺乏所致兔淚腺細(xì)胞焦亡因子Caspase-1、IL-18的表達(dá)，改善淚腺功能，這可能是密蒙花顆粒劑治療干眼有效的機(jī)制之一。

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