胡琦 蔣佳紅 李游 鄧知敏 石媛媛 盧丹陽 朱克儉

〔摘要〕 目的 觀察臭牡丹含藥血清對(duì)B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）蛋白表達(dá)及人肝癌MHCC97-H細(xì)胞周期、凋亡的影響，探討其抗肝癌的可能機(jī)制。方法 15%臭牡丹高、中、低劑量含藥血清作用于MHCC97-H細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;Western blot法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 不同劑量臭牡丹含藥血清作用于細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生稀疏雜亂、折光性增強(qiáng)等改變;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨含藥血清濃度的增加，細(xì)胞的凋亡比例和G2/M期細(xì)胞比例亦相應(yīng)增加，S期細(xì)胞比例降低，中、高劑量組與模型組比較，差異顯著（P<0.05）;Western blot法結(jié)果顯示不同濃度臭牡丹含藥血清干預(yù)下各組Bax蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)降低（P<0.01）。結(jié)論 臭牡丹含藥血清可以促進(jìn)MHCC97-H肝癌細(xì)胞凋亡并阻止其細(xì)胞周期，機(jī)制可能與上調(diào)Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白，影響B(tài)ax/Bcl-2比值有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 臭牡丹;B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2;Bcl-2相關(guān)x蛋白;細(xì)胞周期;細(xì)胞凋亡

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R735.7;R73-3 ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Clerodendron Bungei drug-containing serum on B lymphocyte/leukemia-2 （Bcl-2） and Bcl-2 related X protein （Bax） protein expression and cell cycle and apoptosis of human hepatocarcinoma MHCC97-H， and to explore its possible mechanism. Methods The medicinal serum of 15% Clerodendron Bungei high， medium and low dose drug-containing serum was applied to MHCC97-H cells. The changes in cell morphology were observed using a microscope; The apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method. The flow cytometry was used to detect cell cycle; Western blot was used to detect Bcl-2 and Bax protein expression. Results After different doses of Clerodendron Bungei drug-containing serum were acting on cells， and the cell morphology was sparse and disordered， and the refractive index was enhanced. The results of flow cytometry showed that with the increase of serum concentration， the proportion of cells in apoptosis and the proportion of cells in G2/M phase increased， and the proportion of cells in S phase decreased. The difference between medium and high dose groups was significantly different from that of the model group （P<0.05）. The results of Western blot showed that the expression levels of Bax protein in each group were up-regulated and the expression of Bcl-2 protein was decreased （P<0.01）. Conclusion The drug-containing serum of Clerodendron Bungei can promote the apoptosis of MHCC97-H hepatoma cells and prevent its cell cycle. The mechanism may be related to up-regulating Bax protein， down-regulating Bcl-2 protein and affecting the ratio of Bax/Bcl-2.

〔Keywords〕 Clerodendron Bungei; B cell lymphoma/leukemia-2; Bcl-2-associated X protein; cell cycle; apoptosis

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，《全球癌癥報(bào)告2018》中數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肝癌新增患病人數(shù)居世界首位，5年實(shí)際生存率僅約為33%，死亡人數(shù)高達(dá)全球死亡人數(shù)的42%[1]。目前肝癌治療首選是手術(shù)，但因其起病隱匿、進(jìn)展迅速，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)就已是中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，即使10%～20%小部分行手術(shù)切除患者，術(shù)后復(fù)發(fā)的比例仍然高達(dá)57%～81%，術(shù)后2年復(fù)發(fā)率甚至達(dá)70%以上[2]。所以尋找對(duì)肝癌低毒高效的藥物是改善肝癌療效及預(yù)后的重要研究方向之一。臭牡丹是我國(guó)著名中醫(yī)藥學(xué)家歐陽锜研究員發(fā)掘出的民間治療惡性腫瘤單方，一直被湖湘歐陽氏雜病流派傳承人習(xí)用于各種惡性腫瘤的治療。其效活血散瘀、祛風(fēng)解毒、消腫止痛，與肝癌“化瘀解毒、消瘤散結(jié)”的中醫(yī)治療原則相符合。課題組結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)和科研實(shí)踐，通過前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)臭牡丹可以抗肝癌的發(fā)生發(fā)展[3-6]，但細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制較少涉及，也罕見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選取人肝癌MHCC97-H細(xì)胞株，從細(xì)胞凋亡因子Bcl-2和Bax為切入點(diǎn)，觀察臭牡丹含藥血清對(duì)肝癌MHCC97-H細(xì)胞凋亡和周期的影響并探討其抗肝癌的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取20只6～8周齡SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，采購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，體質(zhì)量控制在250～280 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 ?細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H（庫(kù)號(hào)：ZQ0020）采購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 ?藥物

從湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房購(gòu)臭牡丹飲片，依照《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，鑒定為馬鞭草科大青屬植物臭牡丹Clerodendrum bungei Steud.的地上部分。

1.4 ?主要試劑與儀器

胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10099141），胰酶消化液（碧云天公司，批號(hào)：C0201），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：11965-092），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基，批號(hào)：KGA106），Bcl-2、Bax、β-actin 抗體（美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)分別為：60178-1-Ig、50599-2-Ig、60008-1-Ig）。電泳儀（美國(guó)Bio-rad公司，164-5050），DSZ2000X倒置生物顯微鏡（中國(guó)北京中顯恒業(yè)儀器廠），Cyto FLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司），DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 ?臭牡丹提取物的制備

用臭牡丹飲片適量，加水回流提取2次，第1次加12倍量水，浸泡1 h，回流提取1 h，第2次加7倍量水，回流提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至每毫升相當(dāng)于2 g生藥，加入95%乙醇，調(diào)整含醇量為60%，沉淀24 h后進(jìn)行抽濾，濾液回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至每毫升浸膏相當(dāng)于5 g生藥（經(jīng)換算，每1 g浸膏相當(dāng)于臭牡丹生藥4.14 g），灌裝，滅菌，即得。

2.2 ?含藥血清的制備

20只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組5只。即模型組和臭牡丹提取物高、中、低劑量組。臭牡丹提取物根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量0.5 g/kg臭牡丹生藥用量計(jì)算，高、中、低劑量分別為2.18、1.09、0.55 g/kg，模型組給予生理鹽水。小鼠每日進(jìn)行2次灌胃，第3天末次給藥1 h之后，乙醚進(jìn)行常規(guī)麻醉，然后腹主動(dòng)脈取血，分離血清。將同組大鼠血清混合均勻，過濾后儲(chǔ)存以供之后實(shí)驗(yàn)使用。

2.3 ?細(xì)胞形態(tài)的觀察

常規(guī)培養(yǎng)MHCC97-H細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，次日加入15%濃度的高、中、低劑量組含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后顯微鏡下觀察各組含藥血清干預(yù)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.4 ?細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

待藥物分別干預(yù)48、72 h后，用PBS洗后，過300目篩，重懸細(xì)胞于Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC及Propidium Iodide混勻，在避光條件下室溫反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 ?細(xì)胞周期的檢測(cè)

待藥物干預(yù)細(xì)胞72 h之后，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行收集，離心后得細(xì)胞沉淀，用PBS液洗滌2～3次，加入預(yù)冷的100%乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，4 ℃ 放置過夜固定。固定后將乙醇溶液去掉，加入 PI（碘化丙啶）工作液150 μL，在4 ℃避光條件下染色30 min。轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 ?Western blotting測(cè)定Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

待藥物干預(yù)細(xì)胞72 h之后，嚴(yán)格遵照BCA蛋白定量試劑盒（Wellbio）的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離和提取，用苯二甲芐基氯化銨蛋白濃度測(cè)定法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，掃描底片，蛋白相對(duì)表達(dá)量以灰度值比值表示。

2.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，并進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢測(cè)，符合正太性及方差齊性則使用單因素方差分析，如不滿足，則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?臭牡丹含藥血清MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下，模型組MHCC-97H細(xì)胞貼壁良好，胞漿豐富，呈多邊形，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片;臭牡丹各組干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變得稀疏雜亂、折光性增強(qiáng)，培養(yǎng)基中漂浮的細(xì)胞增多，中、高劑量組尤為明顯。見圖1。

3.2 ?臭牡丹含藥血清對(duì)MHCC97-H細(xì)胞凋亡的影響

高劑量組與模型組相比，MHCC97-H細(xì)胞的凋亡比例明顯增加。相同劑量藥物干預(yù)48 h和72 h誘導(dǎo)凋亡的效果差異不明顯，模型組48 h和72 h的凋亡率分別為8.35%、8.31%，與臭牡丹組各時(shí)間段最大凋亡率19.48%、19.72%比較，差異顯著（P<0.05）。見圖2和圖3。

3.3 ?臭牡丹含藥血清對(duì)MHCC97-H細(xì)胞周期的影響 臭牡丹含藥血清干預(yù)后各劑量組S期細(xì)胞比例降低，與模型組比較，有顯著差異（P<0.05），中、高劑量組G2/M期細(xì)胞明顯增多（P<0.05）。各劑量組G0/G1期細(xì)胞與模型組比較，無明顯變化，提示臭牡丹含藥血清阻滯細(xì)胞由G2/M期進(jìn)入G0/G1期，進(jìn)一步減少S期，干擾DNA復(fù)制，從而抑制細(xì)胞增殖。見表1。

3.4 ?臭牡丹含藥血清對(duì)凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，Bax蛋白表達(dá)量顯著增加，以中、高劑量組尤為明顯（P<0.01）。而Bcl-2蛋白的表達(dá)量均減少，高劑量組最為明顯，與模型組相比差異顯著（P<0.01）。各給藥組Bax/Bcl-2 蛋白比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2和圖4。

4 討論

肝癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率居第5位，病死率居第3位[7]，因其發(fā)病快、發(fā)現(xiàn)難及預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷進(jìn)步發(fā)展，雖然一部分早期肝癌病人能得到妥善和規(guī)范的手術(shù)治療。但是，由于大部分患者確診時(shí)已到中晚期，且大多伴有肝硬化等嚴(yán)重并發(fā)癥，能夠進(jìn)行早期手術(shù)切除治療者畢竟是小部分[8]。近年來傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腫瘤方面顯示出的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而日益被重視，不僅可以改善腫瘤患者的癥狀、提高患者生活質(zhì)量，而且在延長(zhǎng)生存期方面有一定效果。研究初步提示許多單味中藥都能一定程度抑制原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展[9]。臭牡丹是著名中醫(yī)藥學(xué)家歐陽錡研究員發(fā)掘，湖湘歐陽氏雜病流派傳承人治療惡性腫瘤的習(xí)用中藥，具有“活血散瘀、祛風(fēng)解毒、消腫止痛”之功，是符合肝癌中醫(yī)用藥原則的中草藥。

近年來多項(xiàng)研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡過程關(guān)系頗為密切，凋亡過程的異?？赡軐?dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10-11]。Bcl-2和Bax蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵因子，在肝癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，已成為當(dāng)今多種抗癌藥物的作用靶點(diǎn)之一[12]。在有“死亡開關(guān)”之稱的Bax/Bcl-2比值中，Bcl-2基因可抑制細(xì)胞凋亡，而 Bax基因作為Bcl-2的同源基因，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該比值在細(xì)胞接受刺激信號(hào)后是否存活起關(guān)鍵作用。換而言之，Bcl-2/Bax比值越低，細(xì)胞亡率高，反之，細(xì)胞生存率高。因此，無論是上調(diào)Bax，或下調(diào)Bcl-2都可以促進(jìn)包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)的胞凋亡[13]。如郭芳等[14]實(shí)驗(yàn)證明莪術(shù)醇能體內(nèi)外誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與調(diào)控Bcl-2蛋白表達(dá)和Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2/Bax比例有關(guān);另有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、淋巴瘤及肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與Bcl-2的異常表達(dá)關(guān)系密切[15-16];國(guó)外也有研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bax等促凋亡基因后正常細(xì)胞發(fā)生癌變的幾率大大增加[17-18]。

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)和現(xiàn)狀分析，在本實(shí)驗(yàn)中，我們從細(xì)胞凋亡角度探討臭牡丹含藥血清對(duì)MHCC97-H肝癌細(xì)胞周期、凋亡的影響。首先通過鏡下觀察MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)的變化，然后檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡情況。結(jié)果顯示，與模型組相比，臭牡丹含藥血清組干預(yù)后，細(xì)胞出現(xiàn)稀疏雜亂、折光性增強(qiáng)等改變，且細(xì)胞凋亡率和G2/M期細(xì)胞比例亦相應(yīng)增加，S期細(xì)胞比例降低，提示臭牡丹含藥血清可以有效抑制MHCC97-H肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡并阻止其細(xì)胞周期。為進(jìn)一步探討其抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的分子機(jī)制，我們通過對(duì)腫瘤細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2蛋白比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（P<0.01），以高劑量組最為明顯。初步提示臭牡丹提取物可能通過提高Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。課題組將更為深入和清晰的探討臭牡丹抗肝癌的具體機(jī)制，為其治療肝癌提供更充足的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. A Cancer Journal for Clinicians， 2018， 68（6）：394-424.

[2] 宋書紅，郭 ?俊，鄒 ?燦.肝癌手術(shù)切除術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)因素分析[J].實(shí)用肝臟病雜志，2017，20（2）：203-206.

[3] 胡 ?琦，朱克儉，譚小寧，等.臭牡丹總黃酮對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2015，4（2）：166-168.

[4] 胡 ?琦，譚小寧，余 ?娜，等.臭牡丹總黃酮介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[J].世界中醫(yī)藥，2016，6（2）：954-957.

[5] 胡 ?琦，朱定耀，譚小寧，等.臭牡丹提取物對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抑瘤作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2019，35（14）：1459-1462.

[6] 胡 ?琦，朱定耀，譚小寧，等.臭牡丹提取物對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抑瘤作用及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2019，42（7）：1309-1313.

[7] 諸佳瑜，陳 ?闖，歐 ?杰，等.中醫(yī)辯證治療原發(fā)性肝癌的研究進(jìn)展[J]. 當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2017，15（10）：32-34.

[8] BATTETT M， NATHAN H， VANKAYALA H， et al. Recurrence of hepatocellular carcinoma at surgical incision site： case series and review of literature[J]. Ann R Coll Surg Engl， 2017， 99（6）：77-119.

[9] 林 ?慧，梅全喜.單味中藥及其復(fù)方制劑抗腫瘤血清藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2016，27（4）：550-552.

[10] 郭慧敏，李祎亮，劉 ?振.重樓皂苷Ⅱ聯(lián)合喜樹堿對(duì)肺癌H460、H446細(xì)胞凋亡及信號(hào)通路的影響[J].天津中醫(yī)藥，2019，36（2）：165-170.

[11] WEINLICH R， OBERST A， BEERE H M， et al. Necroptosis in

development， inflammation and disease[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2017，18（2）：127-136.

[12] FAZEKAS B， CARTY M P， NEMETH I， et al. Hu COP1 contributes to the regulation of DNA repair in keratinocytes[J]. Mole？鄄cular and Cellalar Biochenistry， 2017， 427（12）：103-109.

[13] LI H， LV B， KONG L， et al. Mediates resistance of rat pheochromocytoma cells to hypoxia-induced apoptosis via the Bax/Bcl-2/caspase-3 pathway[J]. Intermational Journal of Molecular， 2017，40（4）：1125-1133.

[14] 郭 ?芳，黎莉莉，臧林泉.莪術(shù)醇通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)介導(dǎo)抗乳腺癌的機(jī)制研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（10）：1175-1178.

[15] KADERI M A， NORBERG M， MURRAY F， et al. The BCL-2 promoter （-938C>A） polymorphism does not predict clinical outcome in chronic lymphocytic leukeraia[J]. Leukemia， 2008，22（2）：339-343.

[16] WILLIARAS M M， COOK R S. Bcl-2 family proteins in breast development and cancer： could Mcl-1 targeting overcome therapeutic resistance[J]. Oncotarget， 2015，6（6）：3519-3530.

[17] EGLE A， HARRIS A W， BOUILLET P， et al.Bim is a Suppressor of Myc-induced Mouse B Cell Leukemia[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States Of America， 2004，101（16）：6164-6169.

[18] EISCHEN C M， ROUSSEL M F， KORSMEYER S J， et al. Bax loss impairs Myc-induced apoptosis and circumvents the selection of p53 mutations during Myc-mediated lymphomagenesis[J]. Molecular And Cellular Biology， 2001，21（22）：7653-7662.