高瑞松 劉慧英 田雪飛 滕永杰 賀勇凱 王帥 熊偉 林群芳 周青

[摘要]目的探討大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油配伍對(duì)非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎發(fā)揮治療作用的最佳配比。方法正常雄性NOD小鼠220只，按照L8（2⁷）正交表隨機(jī)分為8組，另設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、空白對(duì)照組，共11組，每組20只。按組別給予相應(yīng)干預(yù)，酶聯(lián)免疫吸附法（cnzyme-labeled immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)NOD小鼠前列腺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-αTNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，lL-1β）、白介素-6（interleukin-6.1L-6）、白介素-10（interleukin-10.IL-10）含量的變化，并結(jié)合蘇木素-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色法評(píng)價(jià)前列腺組織病理改變程度，明確大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最佳配比與量效關(guān)系。結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)極差結(jié)果顯示各因素影響強(qiáng)弱依次為虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油，方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎杖苷、大黃素、乳香揮發(fā)油對(duì)療效的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01.P<0.05）。大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最佳配比為大黃素0.1g/kg虎杖苷04g/kg乳香揮發(fā)油0.4g/kg。結(jié)論大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的最優(yōu)比例配伍具有減輕慢性非細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型炎癥的療效，乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間具有協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞]大黃素;虎杖苷;乳香揮發(fā)油;前列腺炎

[中圖分類號(hào)]R285.5;R697+，33[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.004

血-前列腺屏障系統(tǒng)是臨床治療慢性前列腺炎效果欠佳的重要原因。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳香可促進(jìn)虎杖等清熱利濕藥對(duì)慢性前列腺炎大鼠前列腺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度的改善及腺上皮結(jié)構(gòu)修復(fù)的功效。臨床研究也表明，配伍了芳香開竅中藥的加味虎杖散治療男性慢性前列腺炎效果佳。進(jìn)一步的研究表明，乳香可增加前列腺上皮細(xì)胞的通透性，調(diào)節(jié)屏障相關(guān)的細(xì)胞連接蛋白ZO-1、Claudins蛋白表達(dá)的作用，并且不同劑量的乳香對(duì)蛋白表達(dá)的影響具有差異性。因此我們推測(cè)乳香、虎杖的最優(yōu)化劑量配伍，可進(jìn)一步提高藥物對(duì)慢性前列腺炎的治療效果。而中藥乳香、虎杖的主要抗炎成分是乳香揮發(fā)油、大黃素和虎杖苷等。為此，我們采用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)3種有效成分進(jìn)行了治療慢性前列腺炎NOD小鼠的藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠220只，雄性，6周齡，體質(zhì)量20-30g;SPF級(jí)SD大鼠4只，雄性，體質(zhì)量240-300g，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供許可證號(hào)：SCXK（湘）[2016-0002]。

1.1.2主要試劑 百白破疫苗（批號(hào)：201611068-2）購(gòu)自湖南省疾病預(yù)控制中心：大黃素（批號(hào)：20180207384）：虎杖苷（批號(hào)：20180417159），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，均來(lái)自北京索萊寶科技有限公司：乳香購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科：塞來(lái)昔布（規(guī)格200mg/粒，瑞輝制藥有限公司）：CFA完全弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 352型酶標(biāo)儀（Labsystems Multi-skan MS，芬蘭）;AC8洗板機(jī)（Thermo Labsystems，芬蘭）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備 參照文獻(xiàn)方法制備前列腺組織抗原。取雄性SD大鼠4只，處死后分離前列腺組織，剪碎后加入含0.5%TritonX-100及蛋白酶抑制劑的PBS中置冰上勻漿，10000r/min 4℃離心10min，取上清液。BCA法測(cè)定蛋白含量后，蛋白提純液用PBS溶液稀釋至1.0mg/mL濃度，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)方法制備NOD小鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型：前列腺蛋白提純液按1：1加入CFA完全弗氏佐劑乳化，第0天和第15天進(jìn)行NOD小鼠的多點(diǎn)皮下注射（每點(diǎn)注射0.5mL，左腳墊、右腳墊、尾根部基部、左肩胛、右肩胛），同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.1mL。第21天時(shí)每組處死2只NOD小鼠，分離前列腺組織，經(jīng)病理學(xué)驗(yàn)證，間質(zhì)及腺腔內(nèi)可見(jiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腺腔內(nèi)有大量脫落細(xì)胞及少量炎性細(xì)胞，造模成功。

1.2.2藥物制備 按照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》附錄XD中水蒸氣蒸餾法提取乳香揮發(fā)油。大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油配伍混懸液臨用前配制，按組別要求以0.5%的羧甲基纖維素鈉為助溶劑配制大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油的配伍混懸液，并在室溫下充分?jǐn)嚢?0min以上。

1.2.3三因素二水平正交設(shè)計(jì) 將中藥有效成分大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油分別按照不同比例配伍，通過(guò)采用3因素即A大黃素、B虎杖苷、C乳香揮發(fā)油，2水平即低、高2個(gè)劑量的正交表L8（2⁷）進(jìn)行設(shè)計(jì)，主要考察A、B、C三個(gè)因素在治療慢性前列腺炎療效中的主次作用，同時(shí)考慮乳香揮發(fā)油分別與大黃素、虎杖苷之間的一級(jí)交互作用，對(duì)虎杖一乳香有效成分配伍進(jìn)行優(yōu)選。優(yōu)選結(jié)果為8組藥物濃度：分別為A₁B₁C₁（正交1組）、A₁B₁C₂（正交2組）、A₁B₂C₁（正交3組）、A₁B₂C₂（正交4組）、A₂B₁C₁（正交5組）、A₂B₁C₂（正交6組）、A₂B₂C₁（正交7組）、A₂B₂C₂（正交8組）。見(jiàn)表1。

1.2.4動(dòng)物分組及干預(yù) 正常雄性NOD小鼠220只，隨機(jī)分為11組：按照L8（2⁷）正交表分8組（正交1組-正交8組），分別予以相應(yīng)干預(yù)措施，并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、空白對(duì)照組，每組20只。大量臨床及文獻(xiàn)驗(yàn)證塞來(lái)昔布作為目前治療慢性前列腺炎的西藥療效確切，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇塞來(lái)昔布為陽(yáng)性對(duì)照藥。根據(jù)人和動(dòng)物體表面積換算方法，陽(yáng)性對(duì)照組給予塞來(lái)昔布0.02g/kg，空白對(duì)照組及模型組給予等容量蒸餾水灌胃。抗原注射22d時(shí)開始灌胃，連續(xù)灌胃14d后處死，分離前列腺組織置-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.5檢測(cè)指標(biāo) （1）病理學(xué)HE染色：NOD小鼠前列腺組織HE染色后光鏡下觀察病理學(xué)改變及炎癥浸潤(rùn)情況，根據(jù)前列腺炎組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定病變情況分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)等級(jí)資料分析判定病變程度;（2）炎癥因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA法，檢測(cè)NOD小鼠前列腺組織勻漿中炎癥因子、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（inter-leukin-10，IL-10）的含量變化。

1.3統(tǒng)計(jì)處理

等級(jí)資料采取秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較若滿足正態(tài)性及方差齊性則采用成組t檢驗(yàn)，若不滿足則采用秩和檢驗(yàn)，通過(guò)正交極差分析、方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1前列腺組織病理學(xué)檢測(cè)

空白組前列腺組織腺體分布及腺泡形態(tài)數(shù)量正常，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)：模型組前列腺組織腺泡數(shù)量減少，凝固體少見(jiàn)，腺上皮局灶性壞死脫落，腺腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞及脫落的腺上皮細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)：陽(yáng)性對(duì)照組前列腺腺體分布及排列基本正常，間質(zhì)輕度增生，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。正交1-8組：正交2、4、6、8組腺體分布及排列基本正常，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)：正交3、5、7組腺腔分泌物內(nèi)見(jiàn)少量脫落細(xì)胞及腺上皮脫落，間質(zhì)內(nèi)輕度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)：正交1組間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腺腔內(nèi)有大量脫落細(xì)胞及少量炎性細(xì)胞。

2.2各組NOD小鼠前列腺組織病變程度比較

參照前列腺炎組織診斷標(biāo)準(zhǔn)和病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分和計(jì)數(shù)，根據(jù)秩均值排序?qū)Ω鹘MNOD小鼠前列腺組織病變程度進(jìn)行分級(jí)并評(píng)價(jià)。方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=158.466.P=0.000），根據(jù)秩均值排序，發(fā)現(xiàn)正交8組及陽(yáng)性對(duì)照組NOD小鼠前列腺組織病變程度低于模型組，陽(yáng)性對(duì)照組及正交2、4、6組的炎癥程度相對(duì)較低，秩均值較低，空白組前列腺組織無(wú)病變，秩均值最高。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1直觀分析 我們采用ELISA法檢測(cè)了各組前列腺組織勻漿中炎癥因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量變化。結(jié)果顯示，各因素對(duì)IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α影響的順序?yàn)榛⒄溶?大黃素>乳香揮發(fā)油，最佳配比方案為A₁B₂C₂，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，低劑量的大黃素有抗炎效果，而高劑量的大黃素反而炎癥控制不佳，故大黃素優(yōu)選出1水平：使用高劑量的虎杖苷能促進(jìn)療效，使炎癥水平降低，故優(yōu)選出虎杖苷2水平。根據(jù)炎癥因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量，將各正交組分別與模型組、陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行組間比較分析，結(jié)果顯示正交2、4、6、8組及陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05.P<0.01）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）正交2.4.6.8組均為乳香揮發(fā)油高劑量組（P<0.05，P<0.01），說(shuō)明高劑量乳香揮發(fā)油對(duì)炎癥水平調(diào)控更優(yōu)：（2）高劑量水平的虎杖苷顯示出更強(qiáng)的改善炎癥狀態(tài)的作用;（3）正交5、6、7、8組均含有高劑量大黃素，與模型組進(jìn)行組間比較，其中正交5、7組P值均大于0.05.說(shuō)明治療效果不明顯：而正交6、8組包含有高劑量乳香揮發(fā)油，與模型組進(jìn)行組間比較，其P值均小于0.01.說(shuō)明療效良好。以上結(jié)果顯示高劑量大黃素反而加重炎癥反應(yīng)，增加炎癥因子的含量，而高劑量大黃素在高劑量乳香揮發(fā)油的拮抗作用下，可提高中藥抗炎作用。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

2.3.2方差分析 未考慮交互作用的前提下，方差分析結(jié)果顯示，各因素影響大小順序：虎杖苷>大黃素>乳香揮發(fā)油。說(shuō)明因素A與因素B的含量高低對(duì)炎癥因子的含量變化具有更直接的影響。見(jiàn)表5。

2.3.3交互作用分析 綜合乳香揮發(fā)油與大黃素、乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間的交互作用，通過(guò)分析4個(gè)觀察指標(biāo)值，通過(guò)四格表計(jì)算，發(fā)現(xiàn)（B+C）效應(yīng)大于B和C單用效應(yīng)，故二者合用存在協(xié)同作用;（A+C）效應(yīng)小于A和C單用效應(yīng)，故二者合用存在拮抗作用。分析結(jié)果說(shuō)明，因素C乳香揮發(fā)油與因素B虎杖苷間具有協(xié)同交互作用，提示乳香揮發(fā)油能促進(jìn)虎杖苷療效：因素C乳香揮發(fā)油與因素A大黃素間具有拮抗交互作用，提示乳香揮發(fā)油能抑制高劑量大黃素副作用。同時(shí)BxC交互作用顯著，而AxC交互作用不顯著，提示因素C乳香揮發(fā)油與因素B虎杖苷的交互作用對(duì)炎癥因子水平的影響顯著。見(jiàn)表6。

3討論

中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎具有一定優(yōu)勢(shì)，如何進(jìn)一步提高中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎的療效，是臨床研究者們一直關(guān)注的問(wèn)題。根據(jù)慢性前列腺炎“敗精瘀阻”的中醫(yī)病機(jī)，結(jié)合前列腺特殊的組織結(jié)構(gòu)及屏障功能特點(diǎn)，圍繞“不通”的病理本質(zhì)，我們將芳香開竅藥物用于促進(jìn)慢性前列腺炎的中藥治療方案中，取得了很好的療效，并發(fā)現(xiàn)芳香開竅藥乳香促進(jìn)前列腺上皮屏障通透性可提高虎杖的療效。為了探討芳香開竅藥物促進(jìn)清熱利濕藥物配伍規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步對(duì)乳香及虎杖主要的有效活性成分進(jìn)行了分析與研究，通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)他們的最佳配伍模式進(jìn)行了探討。

虎杖中的主要有效成分包括蒽醌類和芪類，其中具有抗炎作用的主要成分有大黃素、虎杖苷。據(jù)報(bào)道，虎杖中的蒽醌類組分大黃素具有抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用。其中抗炎抗氧化作用在慢性前列腺炎的治療中具有更重要的意義。在對(duì)抗局部急性炎癥時(shí)，大黃素能發(fā)揮強(qiáng)有力的作用，對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子和黏附分子的表達(dá)有明顯的抑制作用，因此，可治療多種炎癥，并可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α來(lái)抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，還能抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8等炎癥細(xì)胞因子的分泌，對(duì)免疫激活機(jī)制進(jìn)行影響。而虎杖苷可通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放，降低TNF-α、IL-6等含量發(fā)揮抗炎作用。

本研究組前期研究充分證明了虎杖治療慢性前列腺炎的有效性以及芳香開竅藥乳香等的促前列腺上皮屏障通透性提高虎杖療效的作用。本研究中，我們選擇了虎杖中的有效成分大黃素、虎杖苷作為研究因素，并與乳香揮發(fā)油進(jìn)行組合來(lái)探討虎杖、乳香中有效成分治療慢性前列腺炎的配伍規(guī)律，通過(guò)綜合分析各治療組NOD小鼠模型前列腺組織病理及組織勻漿中丁NFF-α、IL-1B、IL-6、IL-10水平變化，發(fā)現(xiàn)虎杖、乳香的有效成分配伍具有良好的控制炎癥作用。直觀分析及方差分析表明，大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油三因素最佳配比水平為A₁B₂C₂，即大黃素為1水平0.1g/kg、虎杖苷為2水平0.4g/kg、乳香揮發(fā)油為2水平0.4g/kg療效更好。此外還發(fā)現(xiàn)，高劑量大黃素使用反而加重炎癥反應(yīng)，我們推測(cè)可能源于大黃素具有瀉下作用，與過(guò)用傷正氣，反而造成免疫紊亂，加重炎癥反應(yīng)有關(guān)?；⒄溶盏淖饔孟鄬?duì)溫和，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控表現(xiàn)出劑量依賴性，高劑量水平的虎杖苷顯示出更強(qiáng)的炎癥改善作用。

三因素大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油，對(duì)NOD小鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎治療作用的影響大小順序?yàn)榛⒄溶?大黃素>乳香揮發(fā)油，提示在治療中發(fā)揮最主要作用是虎杖苷。根據(jù)報(bào)道，無(wú)論在體內(nèi)還是體外，虎杖苷都能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平，例如通過(guò)阻斷TNF-α、IL-6和IL-1B的表達(dá)等方式，從而減輕細(xì)胞受到的炎癥損害，這跟本研究結(jié)果基本相一致。

通過(guò)考察三因素大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油之間的交互作用，發(fā)現(xiàn)乳香揮發(fā)油與虎杖苷之間具有協(xié)同作用，而與大黃素之間具有拮抗作用。乳香揮發(fā)油的這種作用，我們推測(cè)與其前列腺屏障相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，可影響前列腺腺泡及上皮細(xì)胞連接的通透性，從而發(fā)揮與虎杖苷及大黃素之間的協(xié)同或拮抗作用。

綜上所述，中藥虎杖、乳香中有效成分大黃素、虎杖苷、乳香揮發(fā)油按優(yōu)化比例配伍使用具有改善NOD小鼠慢性前列腺炎模型前列腺組織炎癥狀態(tài)的作用。