施肖壟 蔡志欣 郭仲杰 盧園萍 陳美元 廖劍華

摘要：【目的】通過(guò)對(duì)雙孢蘑菇不同類型核心種質(zhì)的基因組重測(cè)序分析，探討雙孢蘑菇不同類型菌株間基因組存在的差異及開(kāi)發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記?！痉椒ā繉?duì)雙孢蘑菇國(guó)內(nèi)外雜交菌株、野生菌株、高產(chǎn)型或優(yōu)質(zhì)型傳統(tǒng)菌株、棕色菌株、不育菌株等共18株核心種質(zhì)進(jìn)行基因組重測(cè)序，應(yīng)用不同的生物信息學(xué)處理軟件，對(duì)測(cè)序得到的原始reads序列與雙孢蘑菇參考基因組H97序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP、SV檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果對(duì)多態(tài)性標(biāo)記分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并實(shí)現(xiàn)DNA水平差異基因挖掘和差異基因功能注釋等?！窘Y(jié)果】樣品測(cè)序共獲得21.63G數(shù)據(jù)量，Q30平均達(dá)到89.10%。樣品的reads與參考基因組H97的比對(duì)效率平均為82.50%，基因組覆蓋度為96.32%，平均深度分別在33X左右?；跍y(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)結(jié)果，共檢測(cè)獲得約813768個(gè)SNP，53840個(gè)InDel，平均每個(gè)個(gè)體獲得924個(gè)SV變異。【結(jié)論】國(guó)內(nèi)外菌株的親緣關(guān)系表明As2796系列與ul系列是世界上并列的兩大雙孢蘑菇雜交品系。

關(guān)鍵詞：食用菌;基因組;SNP;InDel;結(jié)構(gòu)變異

中圖分類號(hào)：S646.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）10-1167-06

0引言

【研究意義】目前，多種食用菌已經(jīng)完成了全基因組測(cè)序，包括雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、草菇（Volvariellavolvacea）、香菇（Lentinusedodes）、黑木耳（AuricuLARIA Heimuer）等。在基因組測(cè)序完成并共享之后，利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行重測(cè)序變得簡(jiǎn)單易行且成本低廉。全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過(guò)序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single NucleotidePolymorphisms，SNP）、插入缺失位點(diǎn)（Insertion/Dele.tion，InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（structureVariation，SV）位點(diǎn)等。通過(guò)生物信息學(xué)手段，可以分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成注釋?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通過(guò)全基因組測(cè)序及重測(cè)序，許多作物重要的農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、抗逆性等基因被鑒定、克隆，這對(duì)改良主要農(nóng)作物、提高產(chǎn)量、研究遺傳變異、開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記用以輔助育種等具有深遠(yuǎn)的意義。我國(guó)科學(xué)家對(duì)家蠶和水稻的重測(cè)序研究已經(jīng)獲得了重要的成果。福建農(nóng)林大學(xué)通過(guò)草菇基因組的測(cè)序及重測(cè)序，獲得基于SV位點(diǎn)的系列SCAR標(biāo)記并用于構(gòu)建遺傳連鎖圖等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從課題組所在單位保藏的400多個(gè)雙孢蘑菇栽培與野生菌株中挑選了18個(gè)不同類型的代表性核心種質(zhì)開(kāi)展基因組重測(cè)序工作?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】結(jié)合生物信息學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨蚪M水平上存在的差異，開(kāi)發(fā)SNP、SV等分子標(biāo)記，并發(fā)掘相關(guān)基因，為進(jìn)一步的雙孢蘑菇遺傳育種工作提供相關(guān)的理論依據(jù)與分子工具。

1材料與方法

1.1供試菌株

雙孢蘑菇18個(gè)核心種質(zhì)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所種質(zhì)資源與遺傳育種研究室保藏并提供，詳見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的培養(yǎng)將供試菌株從試管接入液體PDB培養(yǎng)基中，恒溫24℃、轉(zhuǎn)速220r·min振蕩培養(yǎng)2～3周。

1.2.2基因組DNA提取與檢測(cè)按OMEGA公司真菌基因組DNA提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。提取的基因組DNA樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳（電壓5V·cm）檢測(cè)其帶型，用Nanodrop微量檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)其濃度和雜質(zhì)污染程度。

1.2.3基因組DNA重測(cè)序在北京百邁客（Biomarker）公司進(jìn)行。提取檢測(cè)合格的樣品基因組DNA，用機(jī)械打斷的方法（超聲波）將DNA片段化，QIAquickPCR試劑盒純化，末端修復(fù)、3’端加A、連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的文庫(kù)用IlluminaHiSeqTM 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4重測(cè)序數(shù)據(jù)分析應(yīng)用不同的生物信息學(xué)處理軟件，對(duì)測(cè)序得到的原始reads（雙端序列）進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)估，然后將reads序列與雙孢蘑菇參考基因組H97序列（https：//genomejgi.doe.gov/Agabi_varbisH97_2/Agabi varbisH972.home.html）進(jìn)行比對(duì)，并基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP、SV檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果對(duì)多態(tài)標(biāo)記分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并實(shí)現(xiàn)DNA水平差異基因挖掘和差異基因功能注釋等。使用samtools進(jìn)行去重復(fù)（Mark Duplicates），GATK進(jìn)行局部重比對(duì)（LocalRealignment），堿基質(zhì)量值校正fBase Recalibration）等處理，再使用GATK進(jìn)行SNP的檢測(cè)，過(guò)濾，并得到最終的SNP位點(diǎn)集。使用GATK檢測(cè)長(zhǎng)度小于50bp的小片段InDel，使用snpEff軟件對(duì)SNP和InDel變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋。通過(guò)BreakDancer軟件檢測(cè)SV數(shù)據(jù)集，主要包含刪除（Deletion，DEL）、插入（Insertion，INS）、倒位（Inversion，INV）、染色體內(nèi)易位（Intra-chromosomal Translocation，ITX）、染色體間易位（Inter-chromosomal Translocation，CTX）。

2結(jié)果與分析

2.118個(gè)雙孢蘑菇菌株重測(cè)序數(shù)據(jù)分析

提取的基因組DNA質(zhì)量好，Nanodrop檢測(cè)主峰清晰，OD260/280及OD260/230數(shù)值顯示雜質(zhì)較少，符合重測(cè)序要求。對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行重測(cè)序分析，共獲得21.63G數(shù)據(jù)量，Q30平均達(dá)到89.10%。通過(guò)bwa軟件對(duì)二代基因組測(cè)序得到的短序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，定位測(cè)序reads在參考基因組上的位置，統(tǒng)計(jì)得到樣品的測(cè)序深度、基因組覆蓋度等信息。結(jié)果表明，樣品的reads與參考基因組H97的比對(duì)效率平均為82.50%，基因組覆蓋度為96.32%，平均覆蓋深度約33X（表2）。染色體的覆蓋深度分布圖反映出樣品的測(cè)序隨機(jī)性較好。

2.2 18個(gè)雙孢蘑菇菌株與參考基因組的SNP和SV分析

基于測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組H97的比對(duì)結(jié)果，共檢測(cè)獲得約813768個(gè)SNP，53840個(gè)InDel，平均每個(gè)個(gè)體獲得924個(gè)SV變異（表3）。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，國(guó)內(nèi)雜交菌株如As2796、W192、國(guó)內(nèi)野生菌株Ag78331、AgLH830等與H97比較的SNP、SV數(shù)量分別比國(guó)外雜交菌株如A15、u1、國(guó)外野生菌株ARPl59等大得多，表明國(guó)內(nèi)野生菌株與H97的親緣關(guān)系比國(guó)外野生菌株更遠(yuǎn)，而國(guó)內(nèi)栽培菌株也與國(guó)外栽培菌株具有很大的差異。對(duì)這些變異進(jìn)行了注釋，發(fā)現(xiàn)存在于同義編碼突變的SNP數(shù)量最多，其次是非同義編碼突變和內(nèi)含子區(qū)域。而InDel則主要存在于內(nèi)含子區(qū)域，其次是基因的上游和下游區(qū)。

2.318個(gè)雙孢蘑菇菌株DNA水平的差異基因挖掘

基因中堿基的差異就有可能造成其密碼子的不同，此項(xiàng)分析用于尋找測(cè)序單株與參考基因組之間在基因?qū)用娴牟町?，包括SNP、InDel、SV等。較為典型的差異基因有如下3種：基因中存在非同義突變而產(chǎn)生蛋白差異、基因中存在小的InDel而導(dǎo)致基因功能改變或者喪失、基因中發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能的改變。在本研究的18個(gè)樣品中，和參考基因組H97相比發(fā)生了以上3種變異的基因數(shù)，統(tǒng)計(jì)如表4所示。相比國(guó)外栽培菌株u1、A15系列，國(guó)內(nèi)栽培菌株As2796、W192系列和參考基因組的差異基因數(shù)目較大，這與SNP、SV數(shù)量分析結(jié)果相似。從02分離的不育菌株02-$5與參考基因組有著明顯較少的差異基因，這與它和H97同樣是源自荷蘭的高產(chǎn)類型菌株的單核體有關(guān)。使用BLAST將差異基因與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得了這些基因的注釋，可用于對(duì)差異基因功能作進(jìn)一步的分析。

2.42個(gè)菌株之間比較的SNP和InDel數(shù)目

對(duì)部分菌株進(jìn)行兩兩之間的SNP與InDel比較分析（表5），發(fā)現(xiàn)來(lái)源接近或農(nóng)藝性狀相近的菌株，其SNP和InDel數(shù)目就較少，比如As2796與其回交菌株W192、W192與其子代192-38、U1與其子代A15等。反過(guò)來(lái)說(shuō)結(jié)果也是一致的，不同菌株間SNP和InDel數(shù)目較大的，其生物學(xué)特性和農(nóng)藝性狀差異就大，如國(guó)內(nèi)雜交菌株As2796和國(guó)外雜交菌株U1、U3、A15，國(guó)內(nèi)野生菌株AgLH830與國(guó)外野生菌株ARPl59，02，8213與其不育菌株等，其SNP和Indel的數(shù)目是相近菌株的數(shù)倍以上，其中SNP相差4～26倍，Indel相差4～24倍。

3討論與結(jié)論

以As2796為代表的國(guó)內(nèi)雜交菌株表現(xiàn)為較高產(chǎn)，質(zhì)量?jī)?yōu)，耐粗放，適合農(nóng)業(yè)與中國(guó)式工廠化栽培模式，適合鮮銷(xiāo)與制罐，而以u(píng)1為代表的國(guó)外雜交菌株表現(xiàn)為高產(chǎn)，產(chǎn)量集中，質(zhì)量一般，不耐粗放，適合歐美工廠化栽培模式，較適合鮮銷(xiāo)。從SNP、SV及差異基因數(shù)目可以看出，國(guó)內(nèi)外雜交菌株基因組差異很大。由于As2796的高產(chǎn)親本02與u1的高產(chǎn)親本Somycel9.2（其同核體H97即為參考基因組測(cè)序菌株）都是源自歐洲的高產(chǎn)傳統(tǒng)菌株，SNP、SV及差異基因數(shù)目比較也說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系較為接近，所以可以推斷國(guó)內(nèi)外雜交菌株的差異主要源于另一個(gè)親本的不同。As2796的優(yōu)質(zhì)親本是老法國(guó)種8213，As2796很好地結(jié)合了02的高產(chǎn)與8213的優(yōu)質(zhì)特性，而u1的另一親本為偏高產(chǎn)的米色菌株Somycel53，U1仍主要表現(xiàn)高產(chǎn)的特性，質(zhì)量上不如As2796。因此，As2796系列與U1系列是世界上并列的兩大雙孢蘑菇雜交品系。

國(guó)內(nèi)外野生菌株與H97比較的SNP、SV數(shù)量相差也較大，表明它們可能源自較遠(yuǎn)的分支，這對(duì)創(chuàng)新利用國(guó)內(nèi)野生種質(zhì)、育成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種意義重大。2個(gè)關(guān)系較近的菌株如As2796與W192、W192與192-38，它們之間的SNP、InDel標(biāo)記可以開(kāi)發(fā)成鑒別2個(gè)菌株的DNA標(biāo)記，在菌株鑒別或菌種鑒定中比普通的DNA指紋標(biāo)記更為適用。

本文對(duì)18個(gè)雙孢蘑菇核心種質(zhì)重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步的統(tǒng)計(jì)和分析，獲得了與參考基因組間大量的SNP、InDel和SV位點(diǎn)，提取了18個(gè)菌株的一致性序列，并進(jìn)行了不同菌株之間的分組差異比較，為這些菌株的進(jìn)一步分析奠定了基礎(chǔ)。接下來(lái)將對(duì)部分感興趣的差異和標(biāo)記進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以期為菌株鑒別、遺傳分析、雜交育種等篩選一批有用的基因和分子標(biāo)記。