林斌 黃菊青 官雪芳 鄭炎 徐慶賢 王琦 錢蕾 鄭怡 張臣心 湯銅華 趙孟濤

摘要：【目的】考察解淀粉芽孢桿菌Bacillus Amyloliquefaciens液體肥w208YF施用對鐵觀音烏龍茶產(chǎn)量、品質(zhì)和茶園土壤相關(guān)指標的影響?！痉椒ā坎捎锰镩g小區(qū)試驗，設(shè)w208YlF（解淀粉芽孢桿菌液體肥，菌液濃度為4.00×10cfu·mL，使用量100L·hm）和等量清水對照（cK）2個處理，重復(fù)4次，進行差異性比較?！窘Y(jié)果】w208YF處理的茶葉產(chǎn)量、水浸出物含量和游離氨基酸總量較cK均顯著增加，增幅分別為11.10%、10.60%和8.10%，而茶葉咖啡堿含量則顯著下降，降幅為24.30%;同時，w208YF的茶園土壤肥力（全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)和腐殖酸含量）及微生物多樣性指數(shù)（shannon、simpson指數(shù)及β多樣性）均明顯優(yōu)于cK。【結(jié)論】施用解淀粉芽孢桿菌液體肥w208YF能夠明顯提升茶園土壤肥力及微生物群落多樣性，并顯著提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;液體肥;茶葉;生化品質(zhì);土壤肥力

中圖分類號：S571.1 文獻標志碼：A 文章編號：1008.0384（2019）10-1173-06

0引言

【研究意義】作為世界上的主要產(chǎn)茶國，中國國內(nèi)茶葉消費近年來快速增加，中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示2017年中國茶葉消費量達到193萬t左右，比2015年增長12.21%。同時期全球茶葉消費量由2015年的500萬t增加到2017年的544萬t，無論是從增長的絕對值，還是增長幅度，中國都已成為全球發(fā)展最快和潛力最大的茶葉市場。施肥是提高茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)和茶園可持續(xù)發(fā)展最重要的農(nóng)業(yè)措施之一。近年來，茶園化肥的盲目使用和不合理的施肥模式引起的茶園生態(tài)環(huán)境問題日益凸顯，開發(fā)能夠促進茶園可持續(xù)發(fā)展的環(huán)保高效肥料，顯得尤為重要與迫切?！厩叭搜芯窟M展】目前關(guān)于茶葉施肥的研究已有較多報道，但主要為化肥、有機肥和豆科綠肥的施用，微生物肥料在茶園中的應(yīng)用報道較少。Kim等研究表明解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液能夠顯著促進西瓜的生長。周晨光等研究表明解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑能夠顯著提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。微生物肥料是活體肥料，是21世紀的新型肥料，是一種低碳、純天然、無毒、無害、無污染的微生物菌劑。它主要靠大量有益微生物的生命活動代謝來完成，可提高土壤肥力，增加土壤中有益微生物數(shù)量及活性，改善土壤性狀，防止土壤板結(jié)，提高土壤保肥、保水及抗寒、抗病能力，阻止病原菌入侵，減少植物的病蟲害，促進農(nóng)作物生長，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，改善和還原農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等。微生物肥料從形態(tài)來分有固體和液體兩種。其中液體微生物肥料以其速溶、均勻、即用、能夠噴灌和澆灌以及不易吸濕和結(jié)塊等優(yōu)勢受到種植行業(yè)的青睞?！颈狙芯壳腥朦c】解淀粉芽孢桿菌Bacillus amy-lotiquefaciens是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，它屬于植物促生菌，具有很強的生命力和定植能力，但尚未見該菌劑對茶園土壤肥力及微生物多樣性影響的報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在福建省龍巖市上杭縣蛟潭茶場開展試驗，探討茶園施用解淀粉芽孢桿菌液體肥對茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)以及茶園土壤肥力和微生物多樣性的影響，為茶園微生物肥料的應(yīng)用及茶葉的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1材料

解淀粉芽孢桿菌W208YF：由本課題組從含腐爛稻草的農(nóng)田土壤中分離篩選得到，該菌株于2016年9月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No.13006。

解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF：將解淀粉芽孢桿菌W208接種到LB培養(yǎng)基上，在37°C恒溫搖床中，180r·min振蕩培養(yǎng)24h，制成液體種子;按質(zhì)量體積比為5%的接種量將液體種子接種于發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基（以馬鈴薯淀粉廢水為原料，添加豆粕粉20g·L，調(diào)節(jié)pH值為7.00，在121℃滅菌20min），曝氣，于37%下發(fā)酵72h，在發(fā)酵第24h第一次補充發(fā)酵培養(yǎng)基，補液體積為補充前發(fā)酵液體積的50%，在發(fā)酵第56h第二次補充發(fā)酵培養(yǎng)基，補液體積為補充前發(fā)酵液體積的30%，發(fā)酵72h時檢測其含解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為2.06×10cfu·mL，收集發(fā)酵液，即得解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計試驗地情況：福建省龍巖市上杭縣蛟潭茶場（海拔1000m左右），茶樹品種為鐵觀音，樹齡12年。栽植方式為畦栽密植，栽植密度45000～60000株.hm。該茶園基礎(chǔ)土壤肥力：pn為5.80，全氮0.20%，全磷0.03%，全鉀1.12%，堿解氮138.10mg·kg，有效磷106.70mg·kg，速效鉀297.00mg.kg，有機質(zhì)4.50%，腐殖酸1.71%。

試驗設(shè)空白對照（CK）和W208YF 2個處理，重復(fù)4次，每個處理小區(qū)面積333m。W208YF處理施用解淀粉芽孢桿菌液體肥，使用前用發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋50倍（菌液終濃度約為4.00×10cfu·mL），施用量：100L·hm，于2016年8月10日和9月1日分別進行葉面噴施和溝施，用量各占50%;空白對照施用等量清水。

于2016年10月20日按“s”法進行布點，沿茶樹樹冠滴水線挖30cm的剖面，在剖面上均勻采集土壤250g，取8個采樣點土壤混合，四分法取500g土樣，采摘按中小開面3～4葉新梢并分小區(qū)計產(chǎn)。統(tǒng)一按鐵觀音做青工藝加工，制成干茶，測定茶葉品質(zhì)生化成分、茶園土壤肥力和微生物多樣性。

1.2.2茶葉品質(zhì)檢測

茶葉水浸出物測定參照《GBT8305-2013茶水浸出物測定》。

游離氨基酸總量參照《GBT8314-2013茶游離氨基酸總量的測定》。

茶多酚測定參照《GBT 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。

咖啡堿測定參照《GBT 8312-2013茶咖啡堿測定》。

1.2.3茶園土壤肥力及微生物多樣性檢測pH、有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮、全磷、全鉀，腐殖酸含量分別根據(jù)NY/T 1377-2007、NY/T1121.6_2006、《土壤農(nóng)業(yè)化學分析法》、NY/T1121.7-2006、NY/T 889_2004、NY/T 53.1987、NY/T88-1988、NY/T 87-1988、《土壤農(nóng)業(yè)化學分析法》進行檢測。茶園土壤微生物檢測：按試劑盒說明書（FastDNA SPINKitforSoil，美國MPBIO公司）提取土壤總DNA，采用16S和ITSMiseqPE300測序平臺對16S rDNA的V3-V4區(qū)進行擴增測序分析，采用QIIME分析軟件分析土壤微生物多樣性。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x+SD）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用Duncan多重比較法，以P<0.05表示組問具有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

由表1可看出，與CK相比，W208YF處理茶葉的產(chǎn)量顯著增加（P<0.05），增幅為11.10%。同時，生化指標檢測結(jié)果顯示，W208YF處理茶葉的水浸出物含量和游離氨基酸含量均顯著增加（P<0.05），二者相對于CK的增幅分別為10.60%和8.10%，而咖啡堿含量顯著降低（P<0.05），降低幅度為24.30%，茶多酚含量稍有增加，但差異不顯著（P>0.05），說明施用W208YF可顯著優(yōu)化茶葉品質(zhì)生化成分。

2.2施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對茶園土壤肥力的影響

表2顯示，與CK比，W208YF處理茶園土壤的全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)和腐殖酸含量均顯著增加（P<0.05），增幅分別達76.30%、81.40%、53.00%、30.50%、81.70%和73.90%，說明施用W208YF能夠顯著提高茶園土壤肥力。

2.3施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對茶園土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物是土壤生物的重要組成部分，在土壤結(jié)構(gòu)形成、有機物質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化、營養(yǎng)元素循環(huán)與利用、作物生長和生態(tài)環(huán)境改善、植物病害抑制或拮抗、溫室氣體排放等方面起著重要的作用，是土壤肥力的重要調(diào)控因子和土壤地力的關(guān)鍵驅(qū)動因子之一，可敏感反映土壤質(zhì)量變化、表征土壤有機質(zhì)代謝旺盛程度，是評價土壤質(zhì)量的主要指標之一。本研究采用16s rDNA法對茶園土壤微生物進行鑒定，采用ACE、Cha01、Shannon和Simpson等指數(shù)來評估施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對茶園土壤微生物多樣性的影響。其中ACE和Cha01表示群落中含有OTU數(shù)目，以估計群落中實際存在的物種數(shù)和物種總數(shù)，ACE和Cha01指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。

表3結(jié)果顯示，施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF的茶園土壤微生物群落Shannon及Simpson指數(shù)明顯較CK更高（p<0.05），說明施用W208YF可顯著提高茶園土壤微生物群落的豐富度和均勻度。

微生物群落的β多樣性一般可采用有度量多維標定法PCoA（Prineipal Coordinate Analysis，主坐標分析）法進行，該方法將樣品排在一定的空間內(nèi)，可體現(xiàn)出樣品間的空間差異。通過PCoA法對CK和W208YF處理（每處理4個重復(fù)）茶園土壤微生物群落差異進行分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，W208YF處理與CK能夠明顯的區(qū)分開來，說明施用W208YF能夠顯著調(diào)節(jié)茶園土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。

3討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌已被證實對多種作物如玉米、小麥、番茄、黃瓜等多種農(nóng)作物均有良好的促生作用，它主要通過改變土壤營養(yǎng)元素的存在形態(tài)或分泌生長素促進作物生長，改善作物品質(zhì)。本研究通過自主篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌W208YF，研究表明該菌可顯著增加茶葉產(chǎn)量，顯著提高茶葉水浸出物、游離氨基酸和茶多酚的含量，這與周晨光等報道的結(jié)果相一致，進一步證實淀粉芽孢桿菌可提高茶葉產(chǎn)量、改善品質(zhì)。另外，與解淀粉芽孢桿菌親緣性極高的枯草芽孢桿菌也被證實對可顯著提高茶葉的產(chǎn)量，是否提高茶葉產(chǎn)量是該類菌的共性還有待進一步研究。

土壤微生物是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的主要驅(qū)動力，現(xiàn)有研究表明使用菌肥可以提高土壤的肥力和作物產(chǎn)量，如張姍姍等采用4種不同產(chǎn)家的菌肥施用西藏桃后，顯著提高了桃樹土壤中機碳、堿解氮、全氮、速效鉀、速效磷及全磷含量，改善了土壤肥力，提高西藏桃產(chǎn)量和品質(zhì)。楊超才等在植煙土壤中施用枯草芽孢桿菌后，土壤堿解氮、速效磷、土壤有機質(zhì)含量顯著增加。本研究首次使用解淀粉芽孢桿菌作為菌肥用于茶園，發(fā)現(xiàn)施用菌W208YF液體肥后可顯著提高堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)和腐殖酸含量，提高幅度高達30.50%～81.70%，證實菌W208YF亦可提高土壤肥力。曾令濤等研究表明解淀粉芽孢桿菌x益生菌的添加活化了土壤養(yǎng)分，增加了土壤細菌、放線菌、解淀粉芽孢桿菌和熒光假單胞菌數(shù)量，降低了土壤真菌數(shù)量，顯著提高了土壤酶活性。本研究也發(fā)現(xiàn)施用菌W208YF液體肥后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的變化，說明菌W208YF可顯著調(diào)整土壤原土著微生物的群落結(jié)構(gòu)，形成的新的微生物群落更能驅(qū)動土壤N、P、K有效態(tài)的轉(zhuǎn)化，促進有機質(zhì)的和腐殖酸的轉(zhuǎn)化形成，提高土壤營養(yǎng)成分并促進鐵觀音茶對土壤營養(yǎng)元素的吸收，進而提高鐵觀音茶的產(chǎn)量和質(zhì)量。

茶葉咖啡堿是茶葉中重要的風味物質(zhì)，它通過興奮中樞神經(jīng)，達到提神醒腦、興奮心臟等功效，長期飲用富含咖啡堿的茶葉將使人體對咖啡堿產(chǎn)生依賴癥，對人體產(chǎn)生不利影響;美國、日本等國家甚至對茶制品中的咖啡堿的含量進行了限量規(guī)定。基于此，為了降低茶葉中咖啡堿的含量，研究人員在優(yōu)化提取工藝降低咖啡堿含量、雜交育種選育、基因工程篩選低含量咖啡堿方面進行大量的研究。本研究使用菌W208YF菌肥噴灑茶葉后，發(fā)現(xiàn)茶葉咖啡堿的含量僅為1.18g'hg，顯著低于普通茶葉含量中的2%～5%，與對照組相比降低幅度高達24.30%，大大高于周晨光等研究中對咖啡堿降低6.36%的幅度，提示可通過施用解淀粉芽孢桿菌W208YF生產(chǎn)出低咖啡堿含量鐵觀音茶葉，為開發(fā)適合高血壓等人群飲用的低咖啡堿含量茶制品提供了理想的原料來源。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌降低茶葉咖啡堿機制尚不清晰，相關(guān)研究有待進一步深入。