廖宗力 孫璐 朱重政 黃文韜 譚靜 陽仁達(dá)

[摘要]目的探討氮酮和冰片作為促透劑運(yùn)用于隔藥餅灸對(duì)高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈病理形態(tài)及血清炎癥因子的影響。方法選取40只新西蘭純種兔隨機(jī)分成5組，每組8只，即正常組、模型組、無促透劑組、氮酮組和冰片組。高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化兔模型造模成功后除正常組和模型組外，其余各組采用隔藥餅灸干預(yù)，每日1次，連續(xù)4周。采用ELISA檢測血清白細(xì)胞介素6（Interleukin 6.IL-6）、白細(xì)胞介素10（Interleukin 10.IL-10）含量;采用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈組織形態(tài)。結(jié)果與正常組比，模型組IL-6水平顯著升高、IL-10水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比，無促透劑組、氮酮組及冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（p<0.05）;與無促透劑比，氮酮組和冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與氮酮組比，冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。主動(dòng)脈組織鏡檢結(jié)果示：正常組無異常;模型組可見組織整體凌亂，管腔壁可見明顯增厚，內(nèi)皮壞死，有明顯的脂質(zhì)斑塊及泡沫細(xì)胞;無促透劑組有內(nèi)膜增厚，可見少量泡沫細(xì)胞，細(xì)胞排列較模型組稍好，脂質(zhì)沉積明顯較模型組減少，斑塊不明顯;氮酮組和冰片組無顯著異常。結(jié)論隔藥餅灸對(duì)高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化兔具有抑制炎癥反應(yīng)和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，在藥餅中加入促透劑后施灸療效更優(yōu)，可能與藥餅中藥物透皮吸收增強(qiáng)有關(guān)，值得進(jìn)一步臨床應(yīng)用和研究。

[關(guān)鍵詞]隔藥餅灸;促透劑;高脂血癥;動(dòng)脈粥樣硬化;白細(xì)胞介素6;白細(xì)胞介素10

[中圖分類號(hào)]R245.8[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.017

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）是由于體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和（或）代謝異常，導(dǎo)致機(jī)體血液脂質(zhì)水平異常的病癥。長期HLP導(dǎo)致脂質(zhì)及泡沫細(xì)胞沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜中，是誘發(fā)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（atheroscle-rosis，AS）的重要危險(xiǎn)因素。有研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿AS病理變化全程，單純降低低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterin，LDL-C）對(duì)AS療效較差，同時(shí)進(jìn)行炎癥控制才能取得良好療效。目前，HLP及AS病越來越高發(fā)，嚴(yán)重影響人們的健康與生活工作。臨床對(duì)HLP及AS治療方法較多且療效確切，但藥物內(nèi)服所致毒副作用一直困擾HLP患者和醫(yī)務(wù)工作者，因此，積極探索安全有效、便捷價(jià)廉、依從性高的降脂外治方案對(duì)促進(jìn)患者健康、延長患者壽命、提高其生活質(zhì)量有著重要的意義。李娟等研究表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法在降脂中療效確切。隔藥餅灸是一種特色中醫(yī)外治療法，課題組前期大量研究表明隔藥餅灸降脂及治療AS療效肯定。因此，本研究探討了在藥餅中加入不同促透劑后施灸對(duì)HLP合并AS兔主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)及血清炎癥因子IL-6、IL-10的影響是否優(yōu)于單純隔藥餅灸，以進(jìn)一步探索增強(qiáng)隔藥餅灸療效的方案。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用40只6-8月齡新西蘭純種兔（體質(zhì)量2.0-2.5kg），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（清潔級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK<湘>2013-0005）。分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。溫度保持20-25℃，濕度保持50%-70%。兔籠、籠架、食槽、水杯在使用前嚴(yán)格消毒處理并定時(shí)沖洗。按時(shí)按量喂養(yǎng)飼料，正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)7d。按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組、模型組、無促透劑組（高脂模型+使用水作溶劑做的藥餅施灸）、氮酮組（高脂模型+使用氮酮溶液做的藥餅施灸）、冰片組（高脂模型組+使用冰片溶液做的藥餅施灸），每組8只。

1.2 主要試劑及儀器

氮酮（新鄉(xiāng)高金藥業(yè)有限公司，59227-89-3），精密量取脂溶性氮酮溶液5mL溶于100mL無水乙醇溶液中，混勻備用：冰片（山東百味堂飲片有限公司，207-352-6），精密稱取冰片2g溶于50mL無水乙醇溶液中，再加入蒸餾水35mL稀釋備用：10%烏拉坦（山東省齊魯興華制藥有限公司，51-79-6）無水乙醇（SIGMA公司，E7023）;4%多聚甲醛（So-larbio）;神灸300灸艾炷（蘇州東方艾絨廠，東方一型）;丙硫氧嘧啶（國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司，XW00515251）;膽固醇（國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司，69008214）;蛋黃粉（亳州海川蛋制品有限公司，57583-35-8）;豬油（市售）。藥餅中藥物組成：丹參、大黃、山楂、郁金、澤瀉（購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房），將所有飲片打粉過200目篩等比例混合。藥餅制作：將藥粉按分組不同分別加入蒸餾水、氮酮溶液、冰片溶液調(diào)成糊狀，比例為每100g藥粉加入80mL溶液，用統(tǒng)一規(guī)格模具制作直徑為1cm，高3mm的藥餅。

酶標(biāo)板（40孔或96孔）;臺(tái)式冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，GTRl6-2）：全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司，ST-36W）;酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，HBS-1096A）;恒溫振蕩器（天津歐諾儀器股份有限公司，HNY-200B）;奧林巴斯顯微鏡（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司，BX43）。兔IL-6ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0014c）：兔IL-10ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0487c）。

1.3模型制備

正常組采用普通飼料喂養(yǎng)，其余動(dòng)物參考方法改良造模：每天于上午8：00喂養(yǎng)高脂飼料，每只兔約吃高脂飼料100g，其中蛋黃粉為15g、膽固醇為0.5g、豬油為5g、丙硫氧嘧啶為10mg/kg，其余為基礎(chǔ)飼料。將以上成分按照比例混合（豬油加熱溶解）拌勻，然后加工成顆粒狀高脂飼料。喂養(yǎng)時(shí)，先喂完高脂飼料后再添加普通飼料，每只兔每天進(jìn)食總量約為100-130g。飲水不限制，連續(xù)喂養(yǎng)12周后，隨機(jī)抽樣解剖見兔主動(dòng)脈內(nèi)壁有脂質(zhì)斑塊出現(xiàn)，參考戴氏標(biāo)準(zhǔn)檢測動(dòng)物血清TC、TG升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明造模成功。

1.4分組干預(yù)

正常組普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)，模型組不予施灸，無促透劑組采用蒸餾水藥餅、氮酮組采用氮酮溶液藥餅、冰片組采用冰片溶液藥餅行隔藥餅灸，每日1次，連續(xù)4周。

1.5 穴位選擇

參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及擬人比照法制定取穴方法，采用如下兩組穴位，每天施灸一組穴位，兩組穴位交替施灸。A組取穴：雙天樞、巨闕、雙豐?。築組取穴：雙心俞、雙脾俞、雙肝俞。

1.6 隔藥餅灸方法

將兔固定在兔臺(tái)上，定位取穴后將穴位周圍2cm兔毛剪除。用8%硫化鈉溶液脫毛至兔皮裸露，用生理鹽水沖洗干凈，確保皮膚無破損。將艾炷放在藥餅上，一起放于穴位上方皮膚處，點(diǎn)燃艾炷施灸。每組穴位隔天灸1次，兩組穴位交替施灸，每穴4炷（約30min），連續(xù)4周。

1.7 檢測指標(biāo)及方法

1.7.1 血清指標(biāo)檢測 將兔固定、麻醉，剪去左側(cè)胸部皮毛，絡(luò)合碘消毒。從左前腋水平向上2-2.5cm（3-4肋間），可以觸摸到心臟的跳動(dòng)，此處為進(jìn)針點(diǎn)?？焖龠M(jìn)針后針頭向內(nèi)胸骨方向與水平面呈45°角刺人，當(dāng)針頭深約3.5cm（9號(hào)針頭）時(shí)抽血。抽取血液3mL注入到10%EDTA-Na 230uL及4x10⁵U/mL抑肽酶40uL試管中，手動(dòng)搖勻，放人3000r/min、4℃恒溫離心機(jī)離心10min。分離血清，ELISA檢測IL-6、IL-10水平。

1.7.2 組織標(biāo)本檢測 將兔麻醉、固定，心臟采血后，空氣栓塞處死。剖開胸腔，剪取從心臟發(fā)出段的主動(dòng)脈弓3cm置于4%多聚甲醛固定液固定，以各級(jí)乙醇將標(biāo)本脫水后用二甲苯透明處理，經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光鏡下（x200倍）觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS18.0windows軟件操作處理。各檢測指標(biāo)都用“x±s”來表示，各組之間進(jìn)行兩兩對(duì)比，如果方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)則用Dunnet′s T3法分析。不滿足正態(tài)分布時(shí)則用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組兔主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)比較

正常組顯示無顯著異常：模型組中整體模糊凌亂，各層分布不均，管腔壁內(nèi)膜可見明顯增厚，內(nèi)膜不光滑不完整，內(nèi)皮壞死，有明顯的泡沫細(xì)胞浸潤及脂質(zhì)斑塊沉積，表明造模成功：無促透劑組示內(nèi)膜仍有增厚，平滑肌細(xì)胞排列無序但較模型組稍好，可見少量泡沫細(xì)胞，脂質(zhì)沉積較模型組明顯減少，斑塊不明顯：氮酮組中整體結(jié)構(gòu)較整齊，內(nèi)膜無明顯增厚，平滑肌細(xì)胞排列較無促透劑組整齊，可見極少量的泡沫細(xì)胞：冰片組整體較無促透劑組、氮酮組更加清晰整齊，無顯著異常。見圖1。

2.2 各組兔血清IL-6、IL-10含量比較

與正常組比，模型組IL-6水平顯著升高（P<0.01）、IL-10水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比，無促透劑組、氮酮組及冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（P<0.05）;與無促透劑組比，氮酮組和冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與氮酮組比，冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），如表1所示。

3討論

HLP是西醫(yī)學(xué)病名，傳統(tǒng)中醫(yī)無對(duì)應(yīng)病名，但中醫(yī)學(xué)中有“膏”“脂”的論述?！鹅`樞》曰：“五谷之津液合而為膏者……?！睆埦霸馈额惤?jīng)》有云：“膏，脂膏也?！蔽麽t(yī)認(rèn)為，血脂升高，會(huì)導(dǎo)致血液粘稠度升高、血液流速減慢，長期高血脂可引起血管內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致脂質(zhì)、血小板等沉積在血管損傷局部，發(fā)生慢性炎癥改變，形成粥樣硬化斑塊。早期癥狀與中醫(yī)痰濁極為相似，后期血管損傷、粥樣斑塊形成與中醫(yī)的“瘀血”相近，因此，中醫(yī)認(rèn)為本病病機(jī)主要為痰濁瘀血阻滯。有研究指出：灸法“以溫促通”，能疏通經(jīng)絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，治療HLP療效較佳。

隔藥餅灸是一種特色灸法，結(jié)合艾燃燒的溫?zé)岽碳?、藥餅中藥物的作用及?jīng)絡(luò)穴位三位一體共同發(fā)揮效用，是針灸療法的重要組成。有研究指出，隔藥餅灸具有明確抗炎作用。IL-6由多種細(xì)胞（如單核/巨噬細(xì)胞等）分泌，研究表明IL_6是促進(jìn)AS形成的一種多功能細(xì)胞因子，且它在AS病理演變過程中大量存在，其導(dǎo)致AS炎癥機(jī)制可能與激活巨噬細(xì)胞，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白的攝人，刺激基質(zhì)降解酶的合成，上調(diào)黏附分子的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，HLP合并AS模型兔血清IL-6顯著高于正常組，采用隔藥餅灸治療后各組血清IL-6水平均顯著低于模型組，提示隔藥餅灸可抑制IL-6表達(dá)，這可能是隔藥餅灸抗炎抗AS的機(jī)制之一。且氮酮組和冰片組IL-6水平下降幅度最大，說明采用兩種促透劑分別運(yùn)用于藥餅后施灸對(duì)抑制IL-6表達(dá)具有增效作用。IL-10主要由CD4+淋巴細(xì)胞和巨細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大抗炎作用。Potteaux等研究表明，AS小鼠IL-10升高能顯著減少AS損傷區(qū)域面積。Galigiuri等發(fā)現(xiàn)敲除大鼠apoE基因，IL-10減少，AS斑塊面積顯著增加，表明升高IL-10具有抗AS作用。本研究結(jié)果顯示，無促透劑組、氮酮組、冰片組IL-IO水平明顯高于模型組，這說明隔藥餅灸通過升高IL-10水平抗炎的作用極其優(yōu)越。但本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與無促透劑相比，氮酮組和冰片組IL-10水平雖然有升高趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明本次實(shí)驗(yàn)中，在藥餅中加入促透劑氮酮或冰片后施灸，對(duì)HLP合并AS兔血清IL-IO的上調(diào)表達(dá)無顯著增效作用，也可能存在影響IL-10表達(dá)的其他因素，有待進(jìn)一步研究探索。

隔藥餅灸作用的發(fā)揮離不開藥餅中的中藥作用。本次實(shí)驗(yàn)藥餅中大黃、山楂、澤瀉、郁金、丹參五味中藥在實(shí)驗(yàn)及臨床研究中多次證實(shí)其有效成分具有明確的降脂作用。有研究表明氮酮和冰片對(duì)多種親水或親脂性藥物成分具有促進(jìn)其透皮吸收的效果。本研究結(jié)果顯示，在藥餅中加入促透劑氮酮或冰片對(duì)血清IL-6水平及主動(dòng)脈組織病理形態(tài)的調(diào)節(jié)作用更顯著，表明隔藥餅灸作用的發(fā)揮可能與藥餅中有效成分的透皮吸收相關(guān)，且冰片組IL-6水平顯著低于氮酮組，說明冰片略優(yōu)于氮酮。

綜上，隔藥餅灸可抑制HLP合并AS兔炎癥反應(yīng)，這可能是隔藥餅灸抗AS的作用機(jī)制之一。同時(shí)，隔藥餅灸能促進(jìn)AS兔主動(dòng)脈組織損傷修復(fù)，在藥餅中加入促透劑后施灸療效更佳，可能與藥餅中藥物透皮吸收增強(qiáng)有關(guān)，值得進(jìn)一步臨床應(yīng)用和研究。