王 銀，邱連建

(廣東深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東 518033)

金佛止痛丸收載于《中國藥典》一部[1]，由白芍、醋制延胡索、佛手、三七、郁金、姜黃與甘草7味中藥組成，具有行氣止痛、舒肝和胃、祛瘀生新的功效，用于氣血瘀滯所致的胃脘疼痛，痛經(jīng)及消化性潰瘍、慢性胃炎引起的疼痛[2]。文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]與《中國藥典》只對(duì)單個(gè)成分進(jìn)行控制，并不能客觀地反應(yīng)其質(zhì)量。本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測定芍藥苷、三七皂苷R1、延胡索乙素3種指標(biāo)成分的含量；該方法高效、準(zhǔn)確，可用于金佛止痛丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260 液相色譜儀，安捷倫公司；XS205DU十萬分之一電子天平，梅特勒托利多公司；SB-5200DTS超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2試藥 芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201842，含量97.4%)、延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)110726-201819，含量99.8%)、三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)110745-201820，含量93.1%)均購于中國食品藥品檢定研究院；金佛止痛丸，規(guī)格5 g/袋，批號(hào)171212、180611、181118，廣州白云山中一藥業(yè)有限公司。乙腈與甲醇均為色譜純(美國西格瑪公司)，磷酸二氫鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為安捷倫XBRIDGE-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇(1∶1)，流動(dòng)相B為0.01 mol/L磷酸二氫鈉，梯度洗脫：0～10 min，10% A；10～44 min，10%→40% A；44～50 min，10% A；流速為 1.0 ml/min；柱溫為 45 ℃；分段變波長測定：0～20.0 min為230 nm，20.0～32.0 min為280 nm，32.0～50.0 min為203 nm；進(jìn)樣20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷、延胡索乙素、三七皂苷R1適量，分別置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置同一50 ml量瓶中，乙醇稀釋至刻度，得含芍藥苷 1 000 μg/ml、延胡索乙素 20 μg/ml、三七皂苷R1250 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液 取金佛止痛丸適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置 500 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理(功率 300 W，頻率40 kHz) 30 min，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 按金佛止痛丸處方比例和工藝，分別制備缺少白芍、延胡索、三七藥材的陰性對(duì)照樣品；并按供試品溶液制備方法制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺白芍、缺延胡索及缺三七的陰性對(duì)照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件進(jìn)行測定，芍藥苷、延胡索乙素、三七皂苷R1分離度均符要求，陰性樣品溶液對(duì)測定無干擾。色譜圖見圖1。

1.芍藥苷 2.延胡索乙素 3.三七皂苷R1

2.4線性關(guān)系試驗(yàn) 精密吸取按“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 ml，分別置 100 ml 量瓶中，以乙醇定容，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表1。

表1 線性回歸方程

2.5精密度試驗(yàn) 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的峰面積。試驗(yàn)顯示，芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1峰面積的RSD值分別為0.7%、1.8%和0.8%，均小于2.0%，表明該方法的精密度符合要求。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金佛止痛丸(批號(hào)171212)6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.114、0.138和1.734 mg/g，RSD 分別為0.4%、1.5%和0.7%，均小于2.0%，表明該方法的重復(fù)性符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)171212)，按“2.1”項(xiàng)下所述的色譜條件，分別放置0、2、4、6、8和12 h 后進(jìn)樣測定，試驗(yàn)顯示芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.1%、1.9%和1.2%，均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批金佛止痛丸(批號(hào)為171212)(芍藥苷含量8.1 mg/g、延胡索乙素含量0.13 mg/g、三七皂苷R1含量1.7 mg/g)9份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3組，每組分別加入0.8、1.0和1.2 ml對(duì)照品溶液(芍藥苷含量8.125 mg/ml、延胡索乙素含量0.135 mg/ml、三七皂苷R1含量1.740 mg/ml)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的平均回收率分別為99.83%、101.18%和99.96%，RSD分別為0.24%、1.24%和0.79%。見表2-4。

表2 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 延胡索乙素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表4 三七皂苷R1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9樣品測定結(jié)果 取3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下所述方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件測定，外標(biāo)法計(jì)算供試品中芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的含量，結(jié)果3批樣品芍藥苷平均含量為8.121 mg/g，RSD為0.01%；延胡索乙素平均含量為0.135 mg/g,RSD為2.61%;三七皂苷R1平均含量為1.738 mg/g,RSD為0.26%。見表5。

表5 樣品中3種成分的含量

3 討論

中成藥的成分相對(duì)于化學(xué)藥成分比較復(fù)雜，《中國藥典》中對(duì)單一成分的控制并不能客觀地評(píng)價(jià)其質(zhì)量。本試驗(yàn)首次建立了高效液相色譜法同時(shí)測定金佛止痛丸中芍藥苷、延胡索乙素和三七皂苷R13種指標(biāo)成分的測定方法。對(duì)于多指標(biāo)的控制，色譜方法的開發(fā)尤為重要。本試驗(yàn)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)與《中國藥典》方法，對(duì)色譜方法進(jìn)行了系統(tǒng)開發(fā)，包括色譜柱的選擇和流動(dòng)相的優(yōu)選。同時(shí)對(duì)于樣品的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，特別是對(duì)提取溶劑與提取方式進(jìn)行了考查，最終確定試驗(yàn)中的制備方法。在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步進(jìn)行有效成分的篩選，建立更加有效與準(zhǔn)確的定量方法。