潘成磊，丁景，董唯，張宇昊，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715)3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

豬肝作為屠宰豬的一種主要副產(chǎn)物，肝臟中的蛋白質(zhì)含量豐富，價(jià)格低廉，且氨基酸組成接近人體所需，是優(yōu)質(zhì)的完全蛋白，研究肝臟蛋白可以為食品工業(yè)的生產(chǎn)及應(yīng)用增添新的蛋白資源[1]。然而，由于豬肝有獨(dú)特腥味、味苦、切片性不好且容易褐變等缺點(diǎn)，致其應(yīng)用范圍受到極大限制，大部分還是傳統(tǒng)意義上的烹飪食用，工業(yè)應(yīng)用率較低。有研究證明豬肝中水溶性蛋白占豬肝蛋白總量的78.6%，可利用價(jià)值很高[2]。與大豆蛋白、乳清蛋白等相比，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)豬肝蛋白乳化特性影響的文獻(xiàn)報(bào)道還相對(duì)較少，因此這方面的研究還需要進(jìn)一步深化，提高豬肝蛋白的商業(yè)利用率和開發(fā)潛力。

熱處理是食品加工中應(yīng)用最廣泛的一種方式，對(duì)改善食物的品質(zhì)、殺滅病菌和保證食品的品質(zhì)安全等各方面均起著重要的作用。同時(shí)，加熱處理也是一種經(jīng)常用到的蛋白質(zhì)改性手段。加熱破壞了蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部疏水基團(tuán)充分暴露，致使其性質(zhì)隨之產(chǎn)生了變化。其中，蛋白的乳化特性受溫度影響較大，不同熱處理溫度對(duì)蛋白乳化性質(zhì)的影響程度差異較大。PENG等[3]研究了熱處理對(duì)豌豆蛋白乳化性能的影響，結(jié)果表明，豌豆蛋白在95 ℃加熱30 min后形成的乳化液中蛋白質(zhì)吸附百分比和乳化穩(wěn)定性高于未加熱的對(duì)照組。CORREDIG等[4]在研究用大豆蛋白穩(wěn)定的水包油體系的熱誘導(dǎo)變化時(shí)，用經(jīng)過75和95 ℃熱處理后的大豆蛋白制成的乳化液的油滴粒徑比未經(jīng)熱處理的蛋白小，但大豆蛋白聚集程度增加。易建華等[5]通過研究影響乳清分離蛋白乳化性的因素發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)其改變較大，且pH不同時(shí)，乳化穩(wěn)定性差異較大。

本課題以豬肝水溶性蛋白為研究對(duì)象，經(jīng)過25、40、50、60、70、80 ℃加熱處理，通過測(cè)定蛋白與大豆油形成的乳化體系的乳化活性和穩(wěn)定性、乳析指數(shù)、界面蛋白濃度等指標(biāo)來研究乳化性質(zhì)的變化，為豬肝蛋白在乳化食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肝(豬屠宰后約3 h購(gòu)于重慶市北碚區(qū)天生菜市場(chǎng))，清洗去血后去除多余脂肪和結(jié)締組織，切成小塊，絞碎為豬肝泥，放置于燒杯中，保鮮膜封口后冷藏于4 ℃冰箱備用。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-4C+酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司； Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L8900氨基酸分析儀，日本日立公司；Power Pac Basic小型垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DXR2拉曼光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性豬肝蛋白的提取

參考STEEN等[2]的方法并稍作修改。稱量一定量的豬肝泥添加到4倍體積0.05 mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖溶液A液中，在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min下持續(xù)勻漿30 s，重復(fù)2次以使蛋白充分溶解；將勻漿物在9 327×g，4 ℃前提下離心30 min，取上層清液，向沉淀中繼續(xù)加入磷酸緩沖溶液A液，重復(fù)以上步驟3次，將所得的上清液混合，用透析袋透析脫鹽，冷凍干燥即為水溶性豬肝蛋白粉。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取一定量的水溶性豬肝蛋白粉，溶解在磷酸緩沖溶液A液中，配制成質(zhì)量濃度為2.5 g/L的豬肝蛋白溶液，把試驗(yàn)樣品分別在常溫(25 ℃)、40、50、60、70、80 ℃環(huán)境下加熱 30 min，探究不同溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化特性的作用。

1.3.3 豬肝水溶性蛋白粉基本成分的測(cè)定

水分的測(cè)定：直接干燥法(GB 5009.3—2010)；粗脂肪的測(cè)定：索氏提取法(GBT 5009.6—2003)；粗蛋白的測(cè)定：凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)；灰分測(cè)定：高溫灰化法(GB 5009.4—2010)。

1.3.4 豬肝水溶性蛋白粉氨基酸組成分析

參照GB/T 5009.124—2003。

1.3.5 豬肝水溶性蛋白粉蛋白濃度的測(cè)定

采用雙縮脲法[6]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考張聰聰[1]的方法并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的豬肝水溶性蛋白添加至4 ℃磷酸緩沖溶液A液內(nèi)，轉(zhuǎn)速2 800 r/min勻漿30 s促使蛋白溶解充分，勻漿過程中盡量減少氣泡的產(chǎn)出，得到1.3.2中描述的蛋白溶液。于25 mL塑料離心管中添加6.0 mL制得溶液和2.0 mL大豆油，轉(zhuǎn)速10 000 r/min勻漿30 s，立刻于距離離心管底0.5 cm位置取50 μL蛋白乳化液添加到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混合均勻后靜置10 min，用紫外分光光度計(jì)在500 nm處測(cè)定其吸光值記作A0。乳化勻漿液靜置10 min后，按照上述同樣方法測(cè)定其吸光值記作A10，用0.1% SDS溶液為空白對(duì)照。豬肝水溶性蛋白乳化活性EAI和乳化穩(wěn)定性ESI的計(jì)算公式(1)、(2)如下：

(1)

(2)

式中：φ為油相體積分?jǐn)?shù)，%；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；A0、A10分別為乳濁液在0、10 min時(shí)的吸光值；稀釋倍數(shù)為101。

1.3.7 乳析指數(shù)的測(cè)定

參考SOLEIMANPOUR等[7]的方法并略作修改。制備新鮮乳液后，立刻移至透明試管(10 mL附有刻度)中，用保鮮膜將其密封，于4 ℃溫度下貯存。豬肝水溶性蛋白乳液靜置后分成上下兩部分，上層乳白色部分為油脂層，下層為清液層。記錄14 d分層情況，乳液分層指數(shù)(creaming index，CI，%)的計(jì)算如式(3)：

(3)

式中：HS為上清液高度；HE為乳液體系的總高度。

1.3.8 表面疏水性的測(cè)定

參照CHIN等[8]的方法測(cè)定。稱量一定質(zhì)量的豬肝水溶性蛋白粉添加至磷酸緩沖溶液A液內(nèi)，轉(zhuǎn)速2 800 r/min勻漿30 s，分散過程中盡量減少氣泡產(chǎn)出，得到1.3.2中描述的蛋白溶液。取1 mL樣液于2.5 mL離心管中，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)，在常溫下振蕩均勻，8 000 r/min離心10 min，將所得上層清液用蒸餾水稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，用磷酸鹽緩沖液替代樣液做空白。豬肝水溶性蛋白表面疏水性計(jì)算如式(4)：

(4)

式中：A對(duì)照為空白對(duì)照組的吸光度值；A樣品為不同溫度處理的樣品。

1.3.9 蛋白粒徑分析

參照崔珊珊[9]的方法測(cè)定豬肝水溶性蛋白乳化液顆粒粒度分布。從新鮮乳化液試管底部取200 μL添加至 5 mL 10 g/L SDS溶液中，混合搖勻，用馬爾文激光粒度分析儀檢測(cè)豬肝水溶性蛋白乳化液乳化顆粒粒度分布情況。用體積等效平均粒徑(D4,3)表示乳化顆粒粒徑分布。參數(shù)設(shè)定為：激光衍射波長(zhǎng)λ=633 nm，傅里葉構(gòu)象焦距為45 mm；進(jìn)樣器為Hydro 2000MU(A)；顆粒折射率為1.520，顆粒吸收率為0.1； 水為分散劑，折射率為1.330，噪音為30 s；背景測(cè)試持續(xù)時(shí)間為15 s；攪拌速度為2 000 r/min。

1.3.10 蛋白吸附量的測(cè)定

參考PALAZOLO等[10]的測(cè)定方法并稍作改動(dòng)。配制好新鮮豬肝水溶性蛋白乳液后立刻移至50 mL離心管中，在25 ℃條件下10 000×g離心30 min。利用注射器把下層清液取出，測(cè)定其蛋白濃度。乳液蛋白吸附量計(jì)算如式(5)：

(5)

式中：Cinitial為豬肝水溶性蛋白溶液的濃度；Caq為乳液離心后清液中的蛋白濃度；C0為豬肝水溶性蛋白溶液經(jīng)相同條件離心后(10 000×g，30 min)上清液中的蛋白濃度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.11 SDS-PAGE凝膠電泳

參考白登榮[11]的方法并加以修改。取1.3.10中離心分離出的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行電泳樣品的制備。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，樣品進(jìn)入分離膠之前電流為15 mA，進(jìn)入分離膠之后改為25 mA。

1.3.12 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

先將豬肝水溶性蛋白-大豆油乳化體系均質(zhì)，再?gòu)牡撞咳?0 μL乳液滴在干凈載玻片上，確保沒有氣泡產(chǎn)生，用蓋玻片蓋緊后，放置于光學(xué)顯微鏡下，在10倍目鏡、40倍物鏡的條件下，觀察并拍照。

1.3.13 拉曼光譜測(cè)定

分別從不同處理?xiàng)l件下制得的乳化體系底部取20 μL乳液，滴在載玻片上，樣品的拉曼光譜(600～1 800 cm-1)測(cè)試在DXR2型顯微成像光譜儀上進(jìn)行，所使用功率大約為15 mW，由CCD進(jìn)行信號(hào)接收和光電轉(zhuǎn)換，用50倍長(zhǎng)焦距鏡頭將激光聚焦到放于潔凈載玻片的樣品上。根據(jù)SHAO等[12]的方法設(shè)定光譜條件為：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，狹縫寬50 μm，400 g/mm、3次掃描、積分時(shí)間30 s、分辨率2 cm-1。每個(gè)樣品測(cè)定3次。用ALIX等[13]的方法計(jì)算蛋白質(zhì)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)含量。

1.3.14 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用Origin軟件進(jìn)行作圖；用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示結(jié)果具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肝水溶性蛋白粉的基本成分

新鮮豬肝用水溶性提取法得到的豬肝蛋白粉是多種成分的混合物，以蛋白成分為主，含量為85.15%；其次是灰分，含量為7.69%；水分約為4.82%； 脂肪約為1.45%。其蛋白含量明顯高于大豆35%[14]、牛肉的16.17%[15]、牛乳的4.66%和羊乳的3.73%[16]，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白源，且價(jià)格低廉，潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。

2.2 豬肝水溶性蛋白粉的氨基酸構(gòu)成分析

氨基酸含量及組成是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，表1表明豬肝水溶性蛋白內(nèi)含包括8種必需氨基酸在內(nèi)的17種氨基酸。其中，Glu含量最高，其次是Pro、Leu和Lys。Glu是一種重要的風(fēng)味氨基酸，在食品領(lǐng)域常用作鮮味劑、代鹽劑、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑等，也是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用[17]。Lys是一種人體健康所必需的氨基酸，對(duì)促進(jìn)智力發(fā)育、身體正常生長(zhǎng)和改善營(yíng)養(yǎng)不良狀況等非常重要。支鏈氨基酸包括Val、Ile和Leu，是一種高效的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，可以減少大腦5-羥色胺的產(chǎn)生來緩解人體疲倦感，還具有非常好的抗分解作用。按照WHO/FAO的標(biāo)準(zhǔn)模式，理想蛋白源的必需氨基酸含量約占蛋白所有氨基酸含量的40%，必需氨基酸與非必需氨基酸比例為3∶5[18]。由表1可知，豬肝水溶性蛋白的氨基酸構(gòu)成滿足上述條件，因此豬肝蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白源。

表1 豬肝水溶性蛋白粉氨基酸構(gòu)成分析 單位：g/100g

注：*表示必需氨基酸，支鏈氨基酸包括纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸3種氨基酸。

2.3 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化性的影響

蛋白質(zhì)是一種具有表面活性的化學(xué)物質(zhì)，兼有親水性和疏水性。乳化性是蛋白其中一項(xiàng)重要功能性質(zhì)，是指水和油脂形成乳狀液的能力，可以反映蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-脂肪彼此之間的交聯(lián)能力。乳化活性和乳化穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)蛋白乳化性質(zhì)最常用的兩項(xiàng)指標(biāo)。乳化活性定義為蛋白質(zhì)在加速油水混合過程中，穩(wěn)定油水界面的能力，即指單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定的油水界面的面積。乳化穩(wěn)定性指的是蛋白維持油水混合后不相互分離的乳化特性抗，外界條件干擾的應(yīng)變能力。

不同熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖1所示。隨著熱處理溫度的增高，豬肝水溶性蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性變化保持一致，都表現(xiàn)出共增加后減小的態(tài)勢(shì)。在60 ℃時(shí)，EAI值和ESI值均最大，分別為40.42 m2/g和52.36%。劉禹[19]在研究桑葚籽的蛋白乳化特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白的乳化活性隨溫度的升高先增大后減小，在60 ℃取得最高值。劉慧清[20]得出，熱處理后的羅非魚分離蛋白在50～60 ℃乳化穩(wěn)定性較好，液滴顆粒較小，沒有明顯絮凝現(xiàn)象。這與本研究結(jié)論一致。可能是因?yàn)檫m當(dāng)加熱處理后，豬肝水溶性蛋白內(nèi)部復(fù)雜結(jié)構(gòu)舒展開，疏水性基團(tuán)充分暴露在蛋白分子外面，與油滴接觸面積增多，更有利于蛋白在油水界面的吸附，從而增大了乳化穩(wěn)定性。當(dāng)溫度大于60 ℃時(shí)，熱運(yùn)動(dòng)更加劇烈，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，甚至蛋白因此嚴(yán)重變性，溶解度和疏水性發(fā)生變化，絮凝和聚集加劇，乳化活性和穩(wěn)定性下降。

圖1 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化性的影響Fig.1 Effects of temperature on emulsifying of pork liver water-soluble protein注：圖中不同小寫字母表示差異顯著。下同。

2.4 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液乳析指數(shù)的影響

乳析指數(shù)是評(píng)價(jià)乳化液穩(wěn)定性的重要參數(shù)之一。在4 ℃冰箱中將不同加熱條件下配制好的豬肝水溶性蛋白乳化液放置儲(chǔ)藏14 d，乳化液滴在放置過程中會(huì)發(fā)生上浮、聚結(jié)、絮凝等而導(dǎo)致發(fā)生不同程度的分層現(xiàn)象，包括上層乳化層和下層清液層。

不同的熱處理對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液乳析指數(shù)的作用如圖2所示。伴隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同加熱溫度處理得到的蛋白乳化液乳析指數(shù)均不斷提高。儲(chǔ)藏1 d后，乳化液已經(jīng)發(fā)生明顯分層，體系脫穩(wěn)，乳析指數(shù)均超過50%，且在30～70 ℃，隨著溫度升高，同一儲(chǔ)藏天數(shù)的乳析指數(shù)逐漸減小，證明蛋白經(jīng)適當(dāng)熱處理可以促進(jìn)乳化液的穩(wěn)定性?？赡苁且?yàn)闊崽幚砗蟮呢i肝水溶性蛋白黏度值增加，乳液液滴在油滴表面結(jié)合更加緊密，空間結(jié)構(gòu)更加牢固，相對(duì)活動(dòng)速度減緩，一定程度上抑制了分層現(xiàn)象。蛋黃熱變性后的乳化性質(zhì)研究結(jié)果[21]與彭偉偉[22]研究的熱處理對(duì)豌豆蛋白乳化液分層穩(wěn)定性研究結(jié)論支持了這一推斷。蛋白在80 ℃熱處理后制得的乳液放置3 d后乳析指數(shù)迅速增加，最終分層指數(shù)明顯大于其他組，可能是由于溫度過高使乳液黏度劇烈變化，油水分離，乳化液發(fā)生絮凝變得不穩(wěn)定。

圖2 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液乳析指數(shù)的影響Fig.2 Effects of temperature on the creaming index of pork liver water-soluble protein emulsion

2.5 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以間接表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，也是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)表面活性的重要指標(biāo)，它可以反映在極性環(huán)境中蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)的暴露程度，暴露程度越大時(shí)，疏水性越強(qiáng)[23]。在極端環(huán)境下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)容易被破壞，疏水性基團(tuán)暴露程度增加，蛋白質(zhì)表面疏水性增加，溶解度和乳化性就會(huì)隨之發(fā)生變化。

不同熱處理?xiàng)l件對(duì)豬肝水溶性蛋白表面疏水性的影響如圖3所示。隨著溫度增加，蛋白質(zhì)表面疏水性先降低后升高，在50 ℃時(shí)取得最低值5.35 μg。在30～50 ℃，豬肝水溶性蛋白表面疏水性顯著降低(P<0.05)，可能是因?yàn)檫m當(dāng)加熱致使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，豬肝水溶性蛋白的表面親水性基團(tuán)與水交互作用程度增加使其表面疏水性降低。在50～80 ℃，蛋白結(jié)構(gòu)更加舒展，使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)充分暴露，豬肝水溶性蛋白的溶解度減小，表面疏水性顯著增大(P<0.05)，這與已報(bào)道的鱈魚蛋白乳化性研究結(jié)論保持一致[24]。

造成學(xué)生參加社會(huì)實(shí)踐熱情減退的另一重要原因是學(xué)校和家庭對(duì)大學(xué)生社會(huì)實(shí)踐的不重視。許多高校沒有自己固定的社會(huì)實(shí)踐基地。部分高校對(duì)社會(huì)實(shí)踐的認(rèn)識(shí)并不清晰,誤認(rèn)為社會(huì)實(shí)踐只是參觀和勞動(dòng),沒有從真正的意義上認(rèn)識(shí)到社會(huì)實(shí)踐的內(nèi)涵。而活動(dòng)組織者也未能從社會(huì)的實(shí)際需要和學(xué)生的實(shí)際情況出發(fā),策劃的活動(dòng)方案往往目標(biāo)不明確，沒有深遠(yuǎn)的意義。此外，許多家庭也對(duì)孩子的社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)缺少關(guān)心和關(guān)注。他們普遍認(rèn)為孩子只要認(rèn)真學(xué)習(xí)就好，有的家長(zhǎng)甚至覺得社會(huì)實(shí)踐會(huì)占用孩子的學(xué)習(xí)時(shí)間，分散孩子的注意力。

圖3 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effects of temperature on hydrophobicity of pork liver water-soluble protein

2.6 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液界面蛋白吸附量的影響

界面蛋白吸附量是表明乳化液穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)。通常，界面蛋白吸附量越多，乳化液穩(wěn)定性越高[25]。溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液界面蛋白吸附量的影響如圖4所示。伴隨溫度提升，界面蛋白吸附量先增多后減少，60 ℃達(dá)到最大值，為54.52%，此時(shí)乳化液最穩(wěn)定，這和2.1得出的結(jié)論一致?？赡苁且?yàn)闊崽幚斫档土说鞍踪|(zhì)的表面疏水性，使乳化顆粒相互分散開，能夠讓乳化液中的油滴更好地與水溶性蛋白相互作用，大量肌球蛋白或肌動(dòng)蛋白會(huì)包裹在油滴表面，形成一層比較厚的蛋白膜，從而提高了界面蛋白吸附量。LI等[26]得出的熱處理后的大豆蛋白制備的乳化液中的蛋白吸附量高于未經(jīng)處理的大豆蛋白乳化液中的蛋白吸附量證明了這一推論。

圖4 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液界面蛋白吸附量的影響Fig.4 Effects of temperature on the interfacial protein content of pork liver water-soluble protein emulsion

2.7 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液界面蛋白組成的影響

不同溫度加熱的豬肝水溶性蛋白穩(wěn)定的乳化液吸附蛋白電泳圖如圖5所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量電泳圖對(duì)照可知，各組樣品中界面蛋白膜主要成分為肌球蛋白重鏈(200 kDa)、肌動(dòng)蛋白(41～61 kDa)、原肌球蛋白(34～36 kDa)、肌鈣蛋白(30～37 kDa)，且蛋白膜組分中肌球蛋白的含量最高。從電泳條帶數(shù)量和條帶顏色深淺可以看出，60 ℃豬肝水溶性蛋白-大豆油乳化體系中界面蛋白吸附量與其他溫度組相比有所增加，MHC和Actin條帶顏色加深比較明顯，與2.6 得出的伴隨溫度上升，界面蛋白吸附量先增多后減少，60 ℃達(dá)到最大值的結(jié)論一致。

泳道M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白(marker)；泳道1～6為溫度分別為25、40、50、60、70、80 ℃；MHC-肌球蛋白重鏈；Actin-肌動(dòng)蛋白圖5 不同溫度加熱蛋白穩(wěn)定的乳液中吸附蛋白電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of adsorbed proteins in emulsions stabilized by proteins heated at different temperature

2.8 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液顆粒粒徑分布的影響

顆粒粒徑是評(píng)價(jià)乳化液乳化性能的一個(gè)重要指標(biāo)。不同溫度處理的豬肝水溶性蛋白溶液制得的乳化液顆粒平均粒徑如圖6所示。

圖6 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液平均粒徑的影響Fig.6 Effects of temperature on the average particle size of pork liver water-soluble protein emulsion

由圖6可知，在25～60 ℃，乳化顆粒粒徑逐漸減小且差異性顯著(P<0.05)，乳化體系粒徑范圍為0.88～1.29 μm，60～80 ℃，乳化顆粒粒徑先增加后減小且差異性顯著(P<0.05)，乳化體系粒徑范圍為0.99～1.25 μm。不同加熱溫度處理的豬肝水溶性蛋白溶液制得的乳化液顆粒粒度分布如圖7所示。

圖7 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液微粒粒度分布的影響Fig.7 Effects of temperature on droplet size distribution of pork liver water-soluble protein emulsion

不同溫度乳液樣品中微粒均呈現(xiàn)雙峰分布，即占主導(dǎo)地位的主峰和從屬地位的肩峰。溫度為25、40、50 ℃的豬肝水溶性蛋白乳液樣品粒徑峰值都有向較小方向移動(dòng)的趨勢(shì)，但當(dāng)60 ℃時(shí)，乳化體系為單峰分布，在850 nm處峰值最大為23%左右，符合圖6溫度為60 ℃時(shí)粒徑最小的結(jié)論。70和80 ℃粒徑范圍大致相同，但80 ℃峰面積較小，符合圖6溫度80 ℃時(shí)粒徑較小的結(jié)論。

2.9 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液液滴微觀結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡可以直觀地反映出乳化液的液滴顆粒分布情況。不同加熱條件處理的豬肝水溶性蛋白穩(wěn)定的乳化液液滴微觀結(jié)構(gòu)如圖8所示。25、70和80 ℃處理的蛋白溶液制得的乳化液體系液滴顆粒較大且分布不均勻，出現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象，40、50和60 ℃處理的樣品乳化液的液滴顆粒較小且分布均勻，無明顯液滴聚集現(xiàn)象。蛋白穩(wěn)定的乳化液發(fā)生聚集或絮凝現(xiàn)象是乳液失穩(wěn)的重要表征。由圖8可知，60 ℃乳液顆粒粒徑最小，顆粒大小較為均勻，證明乳化穩(wěn)定性最好，符合上述結(jié)論。

圖8 熱處理溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化體系微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effects of temperature on microstructure of pork liver water-soluble protein emulsion

2.10 乳化層蛋白質(zhì)構(gòu)象的拉曼光譜

不同溫度的豬肝水溶性蛋白制得的乳化液在600～1 800 cm-1進(jìn)行拉曼光譜掃描的結(jié)果如圖9所示。

圖9 溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液拉曼光譜的影響Fig.9 Effects of temperature on raman spectroscopy of pork liver water-soluble protein emulsion

拉曼光譜頻率和密度的變化可以作為不同條件處理的蛋白乳化液二級(jí)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境變化的標(biāo)志。拉曼光譜條帶的指認(rèn)參考文獻(xiàn)LI等[28]、XU等[29]、HERRERO等[30-31]。

拉曼光譜的酰胺Ⅰ帶((1 655±5)cm-1)對(duì)其他物質(zhì)或分子的抗干擾能力極強(qiáng)，因此具有顯著的拉曼效應(yīng)，是分析鑒定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的可靠模型[32]。一般來說，拉曼圖譜中α-螺旋含量最高的波長(zhǎng)區(qū)域?yàn)? 645～1 660 cm-1，β-折疊結(jié)構(gòu)的主區(qū)域?yàn)? 665～1 680 cm-1，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)主帶為1 680～1 690 cm-1，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)主區(qū)域?yàn)? 660～1 665 cm-1。由圖9可知，當(dāng)溫度逐漸升高時(shí)，酰胺Ⅰ帶峰值發(fā)生明顯的變化，且向右發(fā)生了一些偏移，這說明經(jīng)過熱處理后的豬肝水溶性蛋白吸附在大豆油滴表面時(shí)涉及到二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化。用Alix的方法進(jìn)行豬肝水溶性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量估算結(jié)果如圖10所示，當(dāng)溫度上升時(shí)，α-螺旋含量逐漸降低，β-折疊含量先增加后減小，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加，結(jié)合以上內(nèi)容，說明溫度增加能夠使豬肝水溶性蛋白分子解螺旋，蛋白構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，α-螺旋轉(zhuǎn)變成其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白溶解度增加。有研究表明，β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加能夠提高蛋白乳化液的乳化穩(wěn)定性，同時(shí)可以改進(jìn)乳化體系的保水保油性[33]。本研究中β-折疊結(jié)構(gòu)含量先增加后減小，證明乳化液穩(wěn)定性先增加后減小，符合2.3的結(jié)論。

圖10 溫度對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化液二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.10 Effects of temperature on secondary structure content of pork liver water-soluble protein emulsion

3 結(jié)論

豬肝水溶性蛋白氨基酸組成合理，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白源。本研究所用的熱處理溫度均能對(duì)豬肝水溶性蛋白乳化特性產(chǎn)生不同程度的影響，60 ℃熱處理組的乳化活性和乳化穩(wěn)定性、乳析指數(shù)、界面蛋白含量和種類、液滴粒徑大小和分布、液滴微觀結(jié)構(gòu)、乳化層蛋白質(zhì)構(gòu)象的拉曼光譜等指標(biāo)的變化情況明顯優(yōu)于其他組，處理效果最佳。此結(jié)論為豬肝蛋白的合理利用和豬肝產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)，對(duì)于開發(fā)豬副產(chǎn)品的市場(chǎng)潛力、應(yīng)用前景及提高豬副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)利益具有積極意義。