郭新睿 楊紹華 劉華清 李剛

摘 要：通過對水稻秈型恢復(fù)系明恢86組培變異后代的篩選，得到1個(gè)棉絮狀花序突變體ecp1（encapsulated cotton panicle 1）。棉絮狀花序突變體表現(xiàn)生育期內(nèi)水稻抽穗異常，其小穗部被白色類棉絮物質(zhì)囊狀包裹，無法形成正常的稻穗，進(jìn)而導(dǎo)致無法結(jié)實(shí)。遺傳分析表明，ecp1受單一隱性核基因控制。利用秈稻品種93-11與ecp1突變體雜交的F2群體，通過SSR和InDel標(biāo)記，將ecp1定位于水稻第8染色體約240 kb的區(qū)間。研究結(jié)果為ecp1基因的克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻;棉絮狀花序;突變體;鑒定;基因定位

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2019）09-002

Abstract： A encapsulated cotton panicle mutant （ecp1） was obtained by screening the tissue culture and variant progenies of restorer line Minghui 86 of indica rice. The encapsulated cotton panicle mutant showed abnormal rice heading during the growth period， and its spikelet was enveloped by white cottonlike material， which could not form normal rice spike， and thus could not seed. The genetic analysis showed that ecp1 was controlled by a single recessive nuclear gene. F2 colony from a hybrid of indica rice variety 93-11 and ecp1 mutant was used to locate ecp1 in the region of about 240 kb on chromosome 8 of rice by SSR and InDel markers. The results of this study laid a foundation for the cloning and functional analysis of ecp1 gene.

Key words： Rice; Encapsulated cotton panicle; Mutant; Identification; Gene localization

水稻被廣泛栽培，是世界范圍內(nèi)最重要的糧食作物之一。其產(chǎn)量不但同光照、溫度、水分等環(huán)境因素相關(guān)，而且同自身分蘗、粒型、穗型等息息相關(guān)。鑒于水稻的小穗著生于側(cè)生分枝上，而不是著生在主穗軸上，故其花序稱為總狀花序。又因?yàn)樗净ㄐ蛐嗡茍A錐，所以又被稱為圓錐花序[1]。水稻花序是否可以正常發(fā)育影響著育種學(xué)家特別關(guān)心的產(chǎn)量問題。因此，對水稻的花序以及花器官發(fā)育研究一直以來都是水稻分子遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一。

至今，一些調(diào)控水稻花序發(fā)育的相關(guān)基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）陸續(xù)被克隆。其中，短穗基因SP1（short panicle1） 調(diào)控水稻枝梗分生組織的伸長。此突變體枝梗原基的發(fā)育起始正常，但在枝梗延伸時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重障礙，因而導(dǎo)致短穗[2-3]。DEP2（dense and erect panicle2） 基因則編碼了1個(gè)植物特有的未知蛋白，其主要影響一、二級枝梗和穗軸的伸長[2-4]。OsAPO1/SCM2（aberrant panicle organization 1） 基因造成枝梗分生組織退化時(shí)間的延長，正調(diào)節(jié)小穗數(shù)和一級枝梗的數(shù)目[2-6]。IPA1（ideal plant architecture） 、TAW1（tawawa 1） 和OsASP1（aberrant spikelet and panicle 1） 等基因則是在水稻花序發(fā)育過程中，目前已發(fā)現(xiàn)的影響枝梗分生組織向小穗分生組織轉(zhuǎn)換的主要基因[7-9]。上述一系列花分生組織決定基因的發(fā)現(xiàn)為理解植物花的形成發(fā)育機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)。目前為止，雖然已發(fā)現(xiàn)和克隆了部分花序相關(guān)基因，但是對花在花序中著生位置和花序發(fā)育的遺傳調(diào)控機(jī)制并不清楚，調(diào)控花序發(fā)育的相關(guān)基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。因此繼續(xù)對植物花序形態(tài)突變體的研究很有必要。

本實(shí)驗(yàn)室獲得了1例水稻棉絮狀花序突變體，對該突變體進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明突變體ecp1定位于水稻第8染色體約240 kb的區(qū)間。本研究對水稻的棉絮狀花序突變體進(jìn)行了形態(tài)特征和性狀觀察、遺傳分析以及基因初步定位，為克隆和研究該基因打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

ecp1突變體經(jīng)秈稻恢復(fù)系明恢86組織培養(yǎng)的后代中篩選得到;其他供試材料：ecp1的原始野生型品種明恢 86、 秈稻品種93-11及粳稻品種02428，均由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保留和提供。

1.2 表型鑒定

研究材料ecp1突變體、秈稻品種93-11、野生型明恢86以及粳稻品種02428均種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所福州壽山基地，在整個(gè)生長發(fā)育期內(nèi)，對野生型和突變體材料的表型進(jìn)行觀察并記載。

1.3 群體構(gòu)建和遺傳分析

分別以野生型明恢 86、秈稻品種93-11和粳稻品種02428為母本，ecp1突變體為父本，配制F2分離群體。于抽穗期分別調(diào)查和統(tǒng)計(jì)F2群體中正常株與突變株的數(shù)量，繼而計(jì)算出正常株和突變株的分離比，然后進(jìn)行卡平方測驗(yàn)。

1.4 分子標(biāo)記試驗(yàn)

根據(jù)Gramene 網(wǎng)站（http：//www.gramene.org/）提供的RM系列水稻的SSR標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析和初定位。繼而利用Grame網(wǎng)站的SSRIT軟件掃描粳稻品種Nipponbare（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/download/）的基因組序列，在目標(biāo)基因所在區(qū)域內(nèi)查找出新的SSR位點(diǎn)，并通過BLAST對Nipponbare和秈稻品種93-11（http：//rice.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp） 的基因組序列進(jìn)行比對，尋找插入缺失（InDel）位點(diǎn)。最后利用Web-Premier （http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）軟件，在SSR和InDel 的兩側(cè)設(shè)計(jì)特異引物來開發(fā)新的SSR和InDel標(biāo)記。

1.5 ecp1基因定位

對由水稻ecp1突變體和秈稻品種93-11配制出的F2群體進(jìn)行基因定位。運(yùn)用BSA（Bulked segregant analysis）原理，從F2群體中隨機(jī)抽樣，選取出正常植株和突變植株各10株，通過CTAB法提取出總DNA分別構(gòu)建正常DNA池和ecp1突變DNA池。PCR反應(yīng)體系及PCR產(chǎn)物檢測參照林艷等[10]的方法。以兩親本為對照，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選出來的多態(tài)性分子標(biāo)記，選取水稻的12條染色體上均勻分布的480對分子標(biāo)記，快速尋找到其中與目標(biāo)基因連鎖的部分標(biāo)記。進(jìn)一步選取F2群體中的20個(gè)隨機(jī)水稻棉絮狀花序突變體單株，對其進(jìn)行驗(yàn)證，確定基因所在染色體。最后利用該標(biāo)記所在區(qū)域的多態(tài)性，新開發(fā)出InDel標(biāo)記并分析F3分離群體的180個(gè)單株，對目標(biāo)基因進(jìn)行了定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 ecp1突變體的形態(tài)特征和性狀分析

自然條件下，ecp1突變體表現(xiàn)為生長勢弱，分蘗數(shù)少，穗不能正常發(fā)育，呈棉絮狀。在苗期營養(yǎng)生長正常，表型和野生型（明恢86）相似，分蘗期表現(xiàn)為少分蘗。抽穗期，突變體穗不能正常抽出，不能形成正常枝梗及小穗，類似棉絮（圖1）。因此，將該突變體命名為棉絮狀花序突變體encapsulated cotton panicle 1（ecp1）。

2.2 ecp1突變體的遺傳分析

ecp1突變體與其野生型明恢86、秈稻品種9311和粳稻品種02428進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代植株均發(fā)育正常，可以正常抽穗結(jié)實(shí)。F1自交獲得的F2，經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，ecp1/明恢86、ecp1/9311和ecp1/02488的F2代均出現(xiàn)正常植株與棉絮狀花序突變植株的分離，分離比例分別為416∶120、423∶138和730∶233，卡平方分析表明3個(gè)不同群體分離比均符合3∶1的分離比（表1），說明該突變性狀是由單隱性核基因控制。并且因?yàn)樵诓煌倪z傳背景下，突變體均能表現(xiàn)出明顯的棉絮狀花序表型，表明該突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。

2.3 ecp1突變體的基因定位

利用在兩親本間有多態(tài)性，分布于水稻12條染色體的480對SSR引物對兩個(gè)近等基因池進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)位于第8染色體相鄰的3對SSR引物（RM1376、RM3572和RM3215）對兩基因池?cái)U(kuò)增出具有明顯多態(tài)性的DNA片段（圖2），說明它們可能與目標(biāo)基因ecp1連鎖。進(jìn)一步用這3個(gè)標(biāo)記對138個(gè)F2突變株進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ecp1基因位于RM1376和RM3572之間，與RM1376遺傳距離為3.1 cM，與RM3572的遺傳距離則為3.3 cM。

將分離群體進(jìn)一步擴(kuò)大到180個(gè)隱性單株，參考明恢63和9311的基因組序列，根據(jù)分子標(biāo)記RM3572在9311基因組序列中對應(yīng)的物理位置，在其上游附近開發(fā)了19對大小在80～150 bp的 InDel標(biāo)記。其中InDel0451、InDel0581和InDel5143這3對引物在群體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶（表2），利用RM3572和這3對InDel標(biāo)記引物對上述交換單株進(jìn)行擴(kuò)增，最終將突變基因定位在InDel0451和InDel0581之間，與InDel5143共分離，突變基因與兩標(biāo)記InDel0451和InDel0581之間的物理距離分別為32 kb與108 kb（圖3）。

3 討論與結(jié)論

植物的花序是一個(gè)比營養(yǎng)器官更為復(fù)雜的存在，是在植物花的發(fā)育過程中，營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變所形成的結(jié)構(gòu)。近些年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多個(gè)與植物花發(fā)育相關(guān)的基因以擬南芥和金魚草為模式植物被發(fā)現(xiàn)和獲得，其中一系列花分生組織決定基因的發(fā)現(xiàn)尤為重要，為解釋植物花的形成發(fā)育機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)[11]。對水稻花序突變體及其調(diào)控基因進(jìn)行研究，有助于解析水稻花序發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，對水稻高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種研究具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ecp1突變體出現(xiàn)了穗長變短，花序被白色類棉絮狀葉鞘包裹，無法識別正常小穗結(jié)構(gòu)，單穗無法結(jié)實(shí)等突變表型。遺傳分析顯示，ecp1受1對隱性單基因控制，并將其定位在水稻第8染色體上前段約240 kb 區(qū)間內(nèi)，與已報(bào)道的水稻花序相關(guān)突變基因asp1的定位區(qū)間相近。Asp1 突變體枝梗發(fā)育無序，花序排列不規(guī)則，小穗畸形[9]。本研究ecp1突變體與其表型相似，但呈現(xiàn)出特有的棉絮狀包裹花序的現(xiàn)象，導(dǎo)致完全無法結(jié)實(shí)。至于ecp1突變體與asp1突變體是否是同一基因的突變位點(diǎn)不同導(dǎo)致的表型不同，還是因突變體遺傳背景不同所致，還需要進(jìn)一步對ecp1突變體進(jìn)行序列測定和遺傳共分離分析。同時(shí)，對ecp1突變體與其他突變體的遺傳背景差異進(jìn)行研究，將有助于深入了解ecp1基因調(diào)控水稻花序形成及發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）