雷娜娜 葉浩盈 趙靖悅 龔林 胡榮飛 何文錦 陳由強(qiáng) 薛婷

摘 要：通過RT-PCR的方法克隆三角褐指藻的△5-脂肪酸延長酶基因的cDNA序列，利用雙酶切技術(shù)構(gòu)建重組表達(dá)載體，并對該基因進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶基因的cDNA全長為834 bp，編碼278個(gè)氨基酸，預(yù)測的等電點(diǎn)為9.13，理論分子量32348.91?！?-脂肪酸延長酶基因中存在1個(gè)內(nèi)含子，該酶屬于ELO系列延長酶，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，包含多個(gè)跨膜區(qū)域和保守區(qū)域。親緣關(guān)系分析表明，三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶與假微型海鏈藻的親緣關(guān)系最近。試驗(yàn)還成功構(gòu)建了三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶基因過表達(dá)重組質(zhì)粒pPha-T1-5e，為下一步三角褐指藻中相關(guān)油脂代謝基因的表達(dá)和功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：三角褐指藻;△5-脂肪酸延長酶;克隆;生物信息學(xué)分析;載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q 943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2019）09-001

Abstract： Through the method of RTPCR， cDNA sequence of △5-fatty acid elongase gene of Phaeodactylum tricornutum Bohlin was cloned， and the double enzyme digestion technique was used to construct the recombinant expression vector， and then the related bioinformatics analysis of the gene was carried out. The results showed that the fulllength of cDNA of △5-fatty acid elongase gene in Phaeodactylum tricornutum Bohlin was 834 bp， 278 amino acids were encoded， the predicted isoelectric point was 9.13， and the theoretical molecular weight was 32348.91. There was an intron existed in △5-fatty acid elongase gene， and the enzyme belonged to ELO series elongase， which could be located in the endoplasmic reticulum and contained multiple transmembrance domains and conserved domains. The genetic relationship analysis showed that △5-fatty acid elongase of Phaeodactylum tricornutum Bohlin had the closest relationship with Thalassiosira pseudonana Hasle et Heimdal. The overexpression recombinant plasmid pPhaT15e of △5-fatty acid elongase gene in Phaeodactylum tricornutum Bohlin was also successfully constructed in the experiment， which laid a foundation for the expression and functional verification of related lipid metabolism genes in Phaeodactylum tricornutum Bohlin.

Key words： Phaeodactylum tricornutum Bohlin; △5-fatty acid elongase; Cloning; Bioinformatics analysis; Vector construction

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）是指含有兩個(gè)或多個(gè)雙鍵且碳鏈長度為18個(gè)或更長的碳原子的脂肪酸[1]。PUFAs是真核生物中與細(xì)胞膜的流動(dòng)性和選擇透過性有關(guān)的重要組成成分[2]。特別是二十碳五烯酸（Eicosatetraenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），即ω-3脂肪酸，對人體健康有好處[3]。這些脂肪酸與早期嬰兒期和其他各種生理過程有關(guān)[4-5]。對預(yù)防動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性老年疾病和認(rèn)知功能障礙方面具有重要意義[6-7]。此外，它們還具有促進(jìn)腦部發(fā)育，改善視力，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抗炎、抑制過敏反應(yīng)的作用[8-9]，在治療癌癥方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[10-11]。

目前，多不飽和脂肪酸主要是通過深海魚油獲得[12]。一方面，人們對PUFAs的需求不斷增加，另一方面，由于過度捕撈和環(huán)境污染，海洋漁業(yè)日益衰退，并且魚油具有膽固醇含量高和難聞的腥臭味等缺點(diǎn)，使PUFAs的生產(chǎn)和應(yīng)用受到了限制[13]。所以必須開發(fā)可持續(xù)和可替代的PUFAs來源。海洋微藻作為自然界少數(shù)具有合成多不飽和脂肪酸能力的生物之一，具有分布廣泛，種類多樣，生長速度較快、適應(yīng)能力強(qiáng)、單位面積產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，利用基因工程的方法在海洋微藻中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[15]。

三角褐指藻是海洋硅藻研究的模式物種，屬于硅藻門，羽紋綱，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻屬。三角褐指藻富含ω-3PUFAs，特別是EPA含量很高，占總脂肪酸含量的30%以上[16]。此外，三角褐指藻具有測序完整的基因組序列[17]，且易于遺傳轉(zhuǎn)化[18]，有望成為工業(yè)化生產(chǎn)EPA的原材料[19]。微藻中ω-3PUFAs的合成代謝是以α-亞麻酸（ALA）為底物，在各種脫氫酶和延長酶的催化作用下，經(jīng)過一系列脂肪酸脫氫和脂肪酸延長作用轉(zhuǎn)化成PUFAs，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（ARA）等[20]。其中EPA是在△5-脂肪酸延長酶催化作用下先轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸（DPA），再由△4-脂肪酸脫氫酶合成DHA[21]。因此，對于△5-脂肪酸延長酶的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum購于中國科學(xué)院藻種庫，現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌株、酶及試劑 Escherichia coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存;克隆載體PMD-19T、T4 DNA連接酶、Dreamgreen酶、DNA Marker購于Takara公司;表達(dá)載體pPha-T1購于Addgene公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xba I購于NEB公司;TransTaq DNA Polymerase High Fidelity聚合酶、TRNzoI RNA提取試劑盒、TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基購于生工生物工程（上海）有限公司。采用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻[22]。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermal Cycler PCR儀（美國Applied Biosystems公司）;高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;生化培養(yǎng)箱（國華電器有限公司）;電泳設(shè)備（Cell美國伯樂生物儀器公司）;凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中三角褐指藻的△5-脂肪酸延長酶基因片段（XM_002176650.1）設(shè)計(jì)引物，在引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xba I（下劃線部分），并送生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 總DNA及總RNA的提取 將三角褐指藻接種到裝有300 mL f/2液體培養(yǎng)基的三角瓶中，光照強(qiáng)度為3000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h，溫度20℃，每天搖動(dòng)1～2次[23]。5000 r·min-1離心收集藻液，總DNA提取采用CTAB法[24]，總RNA提取按照TRNzoI RNA提取試劑盒的說明書提取。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，使用總RNA為模板，合成cDNA的第一鏈，并儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 △5-脂肪酸延長酶基因的克隆 以基因組DNA和cDNA為模板，采用高保真HiFi DNA聚合酶，以F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s;60℃退火30 s;72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃恒溫?；厥占兓疨CR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到克隆載體PMD-19T中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有AMP的LB固體平板上篩選陽性克隆。篩選到的陽性克隆通過菌液PCR驗(yàn)證并由生工生物工程（上海）有限公司測序驗(yàn)證。

1.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建流程如圖1所示。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pPha-T1分別用EcoR I、Xba I雙酶切，膠回收試劑盒純化回收之后用T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，采用42℃熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過氨芐抗性篩選陽性克隆，并經(jīng)過菌液PCR鑒定和酶切驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒pPha-T1-5e，并送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 生物信息學(xué)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析使用ExPASy-ProtParam在線程序分析（http：//web.expasy.org/cgibin/protparam/）。蛋白質(zhì)的親水性和疏水性利用ProtScale在線程序預(yù)測（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.p1）;蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域是利用NCBI的CDD在線程序分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）;蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM-2.0在線程序預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）;蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測利用SignalP 4.1 Server在線程序完成（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignaLP/）;多序列比對利用Clustal X軟件比對;二級結(jié)構(gòu)由SOPMA預(yù)測（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）;磷酸化位點(diǎn)利用NetPhos 3.1在線程序預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。使用MEGA4.0軟件對相似序列進(jìn)行多序列比對，并使用鄰接法（Neighbor Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻總RNA的提取及目的基因的克隆

電泳結(jié)果如圖2A所示，出現(xiàn)3條帶，從上往下依次是28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，前2個(gè)條帶比較清晰，第3條帶較模糊，說明完整性較好，沒有發(fā)生明顯的降解。RNA的濃度和純度采用超微量紫外分光光度計(jì)檢測，純度結(jié)果A260/A280在1.8～2.0，所得到的RNA濃度為250 ng·μL-1，總體積為50 μL。說明RNA質(zhì)量比較好，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

獲得的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以cDNA和基因組DNA為模板，獲得目的基因大小分別為834 bp和936 bp，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2B所示。電泳結(jié)果表明，目的基因大小與預(yù)期大小一致?；厥諗U(kuò)增片段連接克隆載體PMD-19T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證并送去測序，測序結(jié)果經(jīng)過Blast在線比對表明，本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的△5-脂肪酸延長酶基因cDNA序列與三角褐指藻的cDNA序列一致。這些結(jié)果表明已擴(kuò)增得到了三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶基因。

2.2 重組過表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將用EcoR I和Xba I雙酶切的基因片段與表達(dá)載體pPha-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，如圖3所示，雙酶切發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒切出約4.1 kb的片段和0.9 kb的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，并將質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測序，顯示結(jié)果正確，說明重組質(zhì)粒pPha-T1-5e構(gòu)建成功。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 通過BioEdit軟件分析三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶基因的核苷酸序列，其中G+C含量為48.20%，A+T含量為51.80%，是1個(gè)完整的開放閱讀框。使用Protparam程序在線分析，該蛋白的等電點(diǎn)為9.13，蛋白質(zhì)分子量為32348.91，分子式推測C1534H2249N373O372S15。不穩(wěn)定指數(shù)為30.20，推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白。預(yù)測在酵母中表達(dá)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中表達(dá)的半衰期大于10 h，而在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為30 h。該蛋白由20種基本氨基酸組成，含量較高的氨基酸殘基為亮氨酸（Leu，12.2%）和纈氨酸（Val，9.4%），含量較低的氨基酸殘基為半胱氨酸（Cys，1.4%）和谷氨酸（Glu，1.8%）。其中有23個(gè)帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys），16個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）。通過protscale程序在線分析，氨基酸序列疏水性/親水性預(yù)測結(jié)果顯示如圖4，親水性平均系數(shù)為0.250，推測其為疏水性蛋白，其脂肪系數(shù)為92.88。

2.3.3 二級結(jié)構(gòu)分析 通過在線軟件SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7。△5-脂肪酸延長酶二級結(jié)構(gòu)包括：α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角、

無規(guī)則卷曲。其中占比最高的為α螺旋，約為43.17%;無規(guī)則卷曲約為29.14%;延伸鏈約為22.66%;而β轉(zhuǎn)角所占比例最少，僅為5.04%。由此可知，α螺旋和無規(guī)則卷曲是△5-脂肪酸延長酶二級結(jié)構(gòu)的主要組成，屬于混合型蛋白。

2.2.4 蛋白多序列比對、保守結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析 NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫分析表明，該蛋白屬于ELO系列家族，如圖8所示。為了進(jìn)一步研究△5-脂肪酸延長酶中的保守結(jié)構(gòu)域，對不同物種的△5-脂肪酸延長酶進(jìn)行序列比對，結(jié)果如圖9所示。發(fā)現(xiàn)氨基酸序列具有典型的△5-脂肪酸延長酶保守結(jié)構(gòu)域FLHXXHH和MYSYY，而后者是微藻△5-脂肪酸延長酶的典型序列。

蛋白質(zhì)磷酸化是真核生物最主要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和活性，因此磷酸化分析對研究蛋白質(zhì)的功能具有重要意義。NetPhos3.1預(yù)測到△5-脂肪酸延長酶中有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，如圖10所示，包含7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

Blast分析發(fā)現(xiàn)三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶與假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）相似性較高，為53%;與巴夫藻（Pavlova）和塔胞藻（Pyramimonas cordata）的△5-脂肪酸延長酶相似性分別為41%和37%。利用GenBank數(shù)據(jù)庫上不同物種的△5-脂肪酸延長酶，使用N-J距離法構(gòu)建了進(jìn)化樹，如圖11所示。結(jié)果表明，三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶與假微型海鏈藻中的△5-脂肪酸延長酶的遺傳距離最近，這表明他們之間的親緣關(guān)系最近。

3 討論與結(jié)論

目前，隨著越來越多的人認(rèn)識(shí)到多不飽和脂肪酸的重要性，脂肪酸相關(guān)酶基因的研究也成為熱點(diǎn)。微藻是多不飽和脂肪酸的主要合成者，已有多種微藻的脂肪酸去飽和酶或延長酶基因被克隆?！?-脂肪酸延長酶是一種多不飽和脂肪酸延長酶，是DHA合成過程中的關(guān)鍵酶。

本試驗(yàn)以三角褐指藻為研究對象，通過RT-PCR的方法克隆得到了△5-脂肪酸延長酶基因的cDNA序列，并通過各種信息學(xué)軟件對其進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹、磷酸化位點(diǎn)等分析。分析結(jié)果表明，△5-脂肪酸延長酶基因的cDNA全長為834 bp，編碼278個(gè)氨基酸，編碼的蛋白為穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。Blast比對和NCBI Spidey分析顯示，該基因有1個(gè)內(nèi)含子，位于DNA序列的468～571 bp處，將整個(gè)基因分成2個(gè)外顯子。藻類中多不飽和脂肪酸的合成位于細(xì)胞質(zhì)中，對△5-脂肪酸延長酶基因細(xì)胞定位的預(yù)測表明，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它是一種膜結(jié)合蛋白，具有較多的跨膜結(jié)構(gòu)域。本試驗(yàn)為微藻脂肪酸延長酶基因的結(jié)構(gòu)和特性的研究提供了參考，為進(jìn)一步研究三角褐指藻中△5-脂肪酸延長酶的基因表達(dá)和確定其功能提供了幫助。本試驗(yàn)還成功構(gòu)建了三角褐指藻△5-脂肪酸延長酶基因過表達(dá)重組質(zhì)粒pPha-T1-5e，為今后三角褐指藻中相關(guān)油脂代謝基因的功能驗(yàn)證及高含量油脂重組藻株的構(gòu)建提供可借鑒的方法。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）