羅秀針 林燕燕 陳雅靜 鄭金華

摘 要：以粘紅酵母RG-31為研究對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其合成蝦青素的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行初步的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：粘紅酵母RG-31最適培養(yǎng)基為葡萄糖10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、K2HPO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1;最適培養(yǎng)條件為pH 6，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速240 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間60 h后，蝦青素含量為7.41 μg·mL-1，是優(yōu)化前（2.84 μg·mL-1）的2.61倍，生物量為20.5 g·L-1，是優(yōu)化前（10.8 g·L-1）的1.90倍。

關(guān)鍵詞：蝦青素;粘紅酵母;培養(yǎng)基;發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ 926 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2019）09-004

Abstract： The culture medium and fermentation conditions for the synthesis of astaxanthin from Rhodotorula glutinis RG-31 were studied by single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the optimal culture medium of Rhodotorula glutinis RG-31 was glucose 10 g·L-1， beef extract 3 g·L-1， yeast powder 5 g·L-1， K2HPO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1. The optimal culture condition was the pH of 6， the culture temperature of 28℃， and the rotate speed of 240 r·min-1. After culturing for 60 h， the content of astaxanthin was 7.41 μg·mL-1， which was 2.61 times of that before optimization （2.84 μg·mL-1）， and the biomass was 20.5 g·L-1， which was 1.90 times of that before optimization （10.8 g·L-1）.

Key words： Astaxanthin; Rhodotorula glutinis; Culture medium; Fermentation optimization

蝦青素（Astaxanthin，AST），即3，3’-二羥基-β，β’胡蘿卜素-4，4’-二酮，為萜烯類不飽和化合物，是一種氧化型的類胡蘿卜素[1-2]。廣泛分布在自然界中，是甲殼類動(dòng)物、鮭魚、鳥類以及其他生物中的主要色素。蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化性能[3]，其抗氧化性能較α-生育酚強(qiáng)百倍以上，具有“超級(jí)維生素E”之稱。動(dòng)物試驗(yàn)表明，蝦青素具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化活性、預(yù)防心腦血管疾病以及增強(qiáng)免疫功能的作用[4-6]，因而在食品添加劑、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，蝦青素作為良好的著色劑在貴重魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖方面具有重要價(jià)值。

過去蝦青素主要是從甲殼類動(dòng)物提取，但是提取的費(fèi)用較高。目前蝦青素可通過化學(xué)合成，但化學(xué)合成蝦青素不僅成本高[7];而且結(jié)構(gòu)與天然的蝦青素不同，多為順式結(jié)構(gòu)。因此，急需尋找廉價(jià)的蝦青素來源，來滿足市場(chǎng)需求。利用酵母合成蝦青素具有成本低、易操作、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，且色素提取后菌體單細(xì)胞蛋白可作為餌料、飼料添加劑等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素資源[8]。本研究采用的粘紅酵母RG

-31是經(jīng)誘變后篩選獲得的高產(chǎn)蝦青素突變株，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵主要條件進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步提高蝦青素的得率，并降低生產(chǎn)成本，為今后的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 粘紅酵母RG-31由實(shí)驗(yàn)室篩選誘變后獲得蝦青素產(chǎn)量較高的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1，瓊脂 20 g·L-1， pH 自然。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1， pH 自然。

1.2 主要儀器及藥品

葡萄糖、蛋白胨、丙酮、二甲基亞砜、甲醇試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、恒溫?fù)u床ZWY-2112B（上海智城分析儀器制造有限公司）、紫外分光光度計(jì)（上海精科儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1， pH 自然。初始發(fā)酵條件：250 mL三角瓶裝液量35 mL，接種量為5%，培養(yǎng)溫度為29℃，轉(zhuǎn)速為250 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）最佳碳源的確定。選擇葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、飴糖、糊精、淀粉、麥芽糖、果糖8種不同碳源，初始濃度為15 g·L-1，取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他條件不變，比較不同碳源對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和蝦青素產(chǎn)量的影響。

（2）最佳氮源的確定。分別選擇無機(jī)氮源3種：（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，有機(jī)氮源4種：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米漿為氮源;氮源濃度為8 g·L-1，取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他條件不變，比較不同氮源對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

（3）最佳初始pH的確定。分別將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他條件不變，比較初始pH對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

（4）最佳裝液量的確定。在250 mL三角瓶裝液量分別為25、30、35、40、45 mL，其他條件不變，比較裝液量對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

（5）最佳培養(yǎng)溫度的確定。分別將培養(yǎng)溫度調(diào)整為24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，其他條件不變，比較溫度對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

（6）最佳發(fā)酵時(shí)間的確定。發(fā)酵時(shí)間分別為48、60、72、84 h，其他條件不變，比較發(fā)酵時(shí)間對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

（7）最佳接種量的確定。接種量分別取1%、2%、3%、4%、5%，其他條件不變，比較接種量對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蝦青素含量及粘紅酵母RG-31的生物量為指標(biāo)，選取初始pH（A）、葡萄糖濃度（B）、牛肉膏和酵母粉配比濃度（C）以及溫度（D）為考察因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，各因素與水平見表1。

1.3.4 蝦青素的提取與測(cè)量

（1）蝦青素提取。采用二甲基亞砜法[8]，取10 mL發(fā)酵液離心，用蒸餾水洗滌菌體，加入3.5 mL 55℃的二甲基亞砜，充分振蕩后，加入15 mL丙酮提取蝦青素，在480 nm下檢測(cè)丙酮提取液的吸光值。

（2）蝦青素含量的測(cè)定方法。蝦青素含量的測(cè)定采用分光光度法[9]。計(jì)算公式：細(xì)胞蝦青素質(zhì)量濃度（μg·mL-1）=（A×Va）/（E×Vf）。

（3）生物量的測(cè)定。采用干重法[10]，取10 mL發(fā)酵液于4000 r·min-1離心15 min，去上清，將離心管放置于50～60℃恒溫箱放置24 h后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

碳源種類和添加劑量對(duì)微生物菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的產(chǎn)量均有很大影響。本試驗(yàn)選擇8種不同碳源，初始濃度為15 g·L-1，比較不同碳源對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和蝦青素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示：在供試的碳源中，葡萄糖為碳源時(shí)其生物量和蝦青素含量最高，D-半乳糖、飴糖、糊精、淀粉、麥芽糖的效果較差，因此，選用葡萄糖為培養(yǎng)基的碳源。

2.2 氮源對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

分別選擇無機(jī)氮源3種：（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，有機(jī)氮源4種：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米漿為氮源;濃度為8 g·L-1，比較不同氮源對(duì)粘紅酵母RG-31的生物量和蝦青素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示：在供試的不同氮源中，有機(jī)氮源以牛肉膏和酵母粉為最佳，其生物量和蝦青素含量均較高;無機(jī)氮源雖能較快被微生物吸收利用，但是成分單一，不能夠提供全面均衡的營(yíng)養(yǎng)。因此選用牛肉膏、酵母粉為復(fù)合氮源。

2.3 初始pH對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

選擇不同pH為起始發(fā)酵條件，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)pH為5左右時(shí)，較利于菌體自身的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基初始pH為6 左右對(duì)合成蝦青素較有利。故選擇起始pH為6。

2.4 裝液量對(duì)紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

粘紅酵母為好氧微生物，其生長(zhǎng)和合成蝦青素都會(huì)受到氧氣的影響。通過調(diào)節(jié)搖瓶裝液量研究通氣量對(duì)粘紅酵母RG-31發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4所示，250 mL三角瓶裝液為35 mL時(shí)，粘紅酵母RG-31的生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量最高。當(dāng)裝液量超過35 mL時(shí)，酵母生物量明顯降低，因此裝液量以35 mL宜。

2.5 溫度對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

溫度對(duì)粘紅酵母RG-31的影響結(jié)果如圖5。結(jié)果表明：當(dāng)溫度為24℃時(shí)，生物量最高;當(dāng)溫度在26℃時(shí)，蝦青素含量較高，故發(fā)酵溫度選擇26℃。

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖6可見，發(fā)酵48 h后生物量增長(zhǎng)緩慢，而蝦青素的含量則在60 h出現(xiàn)最大值，72 h后生物量和蝦青素含量都呈下降趨勢(shì)。因此發(fā)酵時(shí)間取60 h。

2.7 接種量對(duì)粘紅酵母RG-31生物量和產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響

由圖7可見，生物量隨著接種量的增加而降低，蝦青素含量的峰值出現(xiàn)在接種量為3%時(shí)，故接種量選擇3%。

2.8 粘紅酵母RG-31發(fā)酵條件正交試驗(yàn)

利用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1軟件作極差和方差分析，結(jié)果如表3、4。表3極差分析表明，以蝦青素含量為指標(biāo)，各因素的主次關(guān)系為A>C>B>D。表3方差分析表明， pH、牛肉膏和酵母粉的配比對(duì)蝦青素產(chǎn)量影響較顯著。結(jié)合極差與方差分析，以蝦青素含量為主要指標(biāo)，其最佳培養(yǎng)條件為A2B1C2D3，即起始pH為6，葡萄糖10 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，酵母粉5 g·L-1， KH2PO4 1.5 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1，培養(yǎng)溫度28℃。粘紅酵母RG-31在此條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，蝦青素含量為6.48 μg·mL-1，生物量為17.7 g·L-1。

2.9 粘紅酵母RG-31的生長(zhǎng)曲線

以正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為發(fā)酵培養(yǎng)基，即pH為6，葡萄糖10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、KH2PO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1，培養(yǎng)溫度28℃。從10 h開始，每隔8 h取樣，測(cè)其蝦青素含量、生物量及pH，繪制粘紅酵母R-31菌株的生化曲線。在整個(gè)試驗(yàn)過程中發(fā)酵液的pH從初始的6.0隨著酵母菌的生長(zhǎng)逐步降低至5.0，又隨著蝦青素積累到最大值時(shí)上升并穩(wěn)定在5.4。如圖8可見，粘紅酵母RG-31生長(zhǎng)過程可以劃分為生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)階段，在20 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)干重迅速增大，同時(shí)蝦青素不斷積累，40 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞干重趨于穩(wěn)定，蝦青素繼續(xù)合成，在64 h時(shí)，蝦青素含量達(dá)到最高值，此時(shí)蝦青素含量為7.41 μg·mL-1，生物量為20.5 g·L-1，分別是優(yōu)化前培養(yǎng)基發(fā)酵的2.61倍及1.90倍。該菌株的衰亡期不明顯，可能是由于該菌株的細(xì)胞壁太厚，菌體不易自溶。

3 小結(jié)與討論

通過搖瓶試驗(yàn)，對(duì)粘紅酵母RG-31的產(chǎn)蝦青素培養(yǎng)基組分及搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究。確定粘紅酵母RG-31產(chǎn)蝦青素的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖10 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，酵母粉5 g·L-1， KH2PO4 1.5 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1。發(fā)酵條件為：初始pH6.0，250 mL三角瓶裝液量為35 mL，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速為240 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間為60 h，蝦青素含量可達(dá)到7.41 μg·mL-1，生物量達(dá)到20.5 g·L-1。通過優(yōu)化試驗(yàn)，使粘紅酵母RG-31蝦青素產(chǎn)量大幅度提高。

參考文獻(xiàn)：

[1]PASHKOW F J，WATUMULL D G，CAMPBELL C L.Astaxanthin：a novel potential treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease[J].American Journal of Cardiology，2008，101（10A）：58-68.

[2]MIKI W，YAMAGUCHI K，KONOSU S.Comparison of carotenoids in the ovaries of marine fish and shellfish[J].Comp Biochem Physiol B，1982，71（1）：7-11.

[3]ZHANG X S，ZHANG X，ZHOU M L，et al.Amelioration of oxidative stress and protection against early brain injury by astaxanthin after experimental subarachnoid hemorrhage[J].Journal of Neurosurgery，2014，121（1）：42-54.

[4]AMBATI R R，HANG S M，RAVI S，et al.Astaxanthin： sources，extraction，stability，biological activities and its commercial applications：a review[J].Marine Drugs，2014，12（1）：128-152.

[5]LI J，WANG F，XIA Y，et al.Astaxanthin Pretreatment Attenuates Hepatic Ischemia ReperfusionInduced Apoptosis and Autophagy via the ROS/MAPK Pathway in Mice[J].Marine Drugs，2015，13（6）：3368-3387.

[6]LI J，XIA Y，LIU T，et al.Protective effects of astaxanthin on ConAinduced autoimmune hepatitis by the JNK/pJNK pathwaymediated inhibition of autophagy and apoptosis[J].PLoS One，2015，10（3）：e120440. DOI：10.1371/journal.pone.0120440.

[7]張曉燕，劉楠，周德慶.天然蝦青素來源及分離的研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2012，28（1）：264-267.

[8]徐學(xué)明，金征宇，劉當(dāng)慧，等.法夫酵母產(chǎn)蝦青素的搖瓶工藝[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19（3）：230-235.

[9]任偉偉，張艾青，王福強(qiáng)，等.海洋紅酵母產(chǎn)蝦青素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].糧食與飼料工業(yè)，2018（9）：39-42.

[10]汪福源，許激揚(yáng)，唐寧，等.誘變紅酵母RY-17生物合成番茄紅素的研究[J].藥物生物技術(shù)，2005，12（6）：375-378.

（責(zé)任編輯：柯文輝）