李志 李琳 石曉峰 范彬

摘 要 目的：建立牡丹花粉口含片的質(zhì)量控制方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定提供參考。方法：按2015年版《中國藥典》（四部）薄層色譜（TLC）法對(duì)牡丹花粉口含片中的芍藥苷、山柰酚、木犀草素進(jìn)行定性鑒別；采用雙波長-高效液相色譜（HPLC）法對(duì)牡丹花粉口含片中的芍藥苷和氧化芍藥苷進(jìn)行定量分析[色譜柱為Agilent TC-C18；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長芍藥苷為230 nm、氧化芍藥苷為258 nm；進(jìn)樣量為20 μL]。結(jié)果：芍藥苷、山柰酚、木犀草素的TLC鑒別結(jié)果顯示，在樣品圖譜中，與對(duì)照品圖譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。芍藥苷和氧化芍藥苷的檢測質(zhì)量濃度分別在7.2～86.4、2.72～32.64 μg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 7）；平均加樣回收率分別為99.12%、98.65%，RSD分別為1.54%、2.53%（n=6）；精密度（n=6）、穩(wěn)定性（n=8）、重復(fù)性（n=6）試驗(yàn)的RSD均小于3.0%。結(jié)論：該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于牡丹花粉口含片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 牡丹花粉口含片；薄層色譜；含量測定；雙波長-高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

Study on Quality Standard for Peony Pollen Buccal Tablets

LI Zhi1，LI Lin1，SHI Xiaofeng1，2，F(xiàn)AN Bin2（1.College of Pharmacy， Gansu University of TCM， Lanzhou 730030， China；2.Gansu Academy of Medical Science， Lanzhou 730050， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for quality control of Peony pollen buccal tablets， and to provide reference for the formulation of quality standard. METHODS： TLC method was used for qualitative identification of paeoniflorin， kaempferol and luteolin in Peony pollen buccal tablets according to 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅳ）. The contents of paeoniflorin and oxypaeoniflorin in Peony pollen buccal tablets were determined by dual-wavelength HPLC method [The determination was perform on Agilent TC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm for paeoniflorin and 258 nm for oxypaeoniflorin. Sample size was 20 μL]. RESULTS： TLC identification of paeoniflorin， kaempferol and luteolin showed that the same color characteristic spots of control chromatogram appeared in the corresponding positions of sample chromatogram without interference from negative samples. The linear range of paeoniflorin and oxypaeoniflorin were 7.2-86.4 μg/mL and 2.72-32.64 μg/mL（r≥0.999 7），respectively. The average recoveries were 99.12% and 98.65%， and RSD were 1.54% and 2.53%（n=6），respectively. RSDs of precision （n=6）， stability （n=8） and reproducibility （n=6） tests were all lower than 3.0%. CONCLUSIONS： The method is simple and reproducible， and can be used for quality control of Peony pollen buccal tablets.

KEYWORDS Peony pollen buccal tablets； TLC； Content determination； Dual-wavelength HPLC； Quality standard

牡丹（Paeonia suffrutcosa）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect. Moutan）多年生落葉灌木[1]，是一種重要的觀賞植物，其根皮在中國有2 000多年的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，在歷版《中國藥典》（一部）中均有收載，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[2]。此外，牡丹的花、籽、根、花粉、葉亦均有很高的食藥和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。其中，花粉是牡丹花雄蕊上的孢子，含有豐富的天然活性成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等一級(jí)代謝產(chǎn)物及黃酮、甾醇、萜類、生物堿等二級(jí)代謝產(chǎn)物，不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝胃、調(diào)節(jié)神經(jīng)、軟化血管等多種藥理作用[4-5]。

前列腺疾病通常包括前列腺炎（Prostatitis）及前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia，BPH），是中老年男性多發(fā)疾病，臨床上BPH又經(jīng)常伴隨著前列腺炎。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，牡丹花粉具有開發(fā)成高效、無毒副作用的治療前列腺疾病特效藥的前景，其中含有的芍藥苷、氧化芍藥苷等糖苷類成分能明顯改善前列腺炎患者的臨床癥狀；而治療BPH的藥效成分主要是脂肪酸類化合物和黃酮類化合物，其中脂肪酸類化合物為多不飽和脂肪酸，黃酮類化合物主要為異鼠李素、山柰酚、木犀草素等。為進(jìn)一步將牡丹花粉開發(fā)成治療前列腺疾病的新藥，本課題組前期將破壁后的紫斑牡丹花粉與甘露醇、乳糖、阿斯巴甜等藥用輔料混合制成了牡丹花粉口含片[9]。在本研究中，筆者擬采用薄層色譜（TLC）法對(duì)口含片中芍藥苷和山柰酚、木犀草素進(jìn)行定性鑒別，并采用雙波長-高效液相色譜法對(duì)口含片中芍藥苷、氧化芍藥苷進(jìn)行定量分析，以期為牡丹花粉口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AE260型萬分之一分析天平（瑞士Mettle-Toledo公司）；SK3310LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HH-2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

牡丹花粉于2015年5月采自蘭州新區(qū)中川牡丹園，其原植物經(jīng)蘭州牡丹園藝開發(fā)公司趙潛龍高級(jí)工程師鑒定為真品；牡丹花粉口含片（甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所自制，批號(hào)：2018103001、2018103002、2018103003，規(guī)格：0.4 g）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-18032901，純度：99.46%）、氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17032810，純度：99.46%）、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16032801，純度：99.80%）均由成都曼思特生物科技有限公司提供；木犀草素對(duì)照品（貴州迪大生物有限公司，批號(hào)：491-70-3，純度：≥98%）；硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20070827）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 牡丹花粉口含片的制備

稱取適量的牡丹花粉、填充劑（乳糖-甘露醇）和矯味劑（檸檬酸-阿斯巴甜），過80目篩，混合均勻后加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，經(jīng)濕法制軟材，然后過18目篩，制得顆粒，于 50 ℃烘干后，經(jīng)30目篩整粒，制成干顆粒，再加入適量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，即得。

2.2 TLC法鑒別牡丹花粉口含片中芍藥苷、山柰酚和木犀草素

2.2.1 芍藥苷 取牡丹花粉口含片適量，研缽研細(xì)，精密稱取粉末5 g，加入50%乙醇溶液100 mL，超聲提取（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤?0 mL正丁醇溶液溶解，減壓回收正丁醇溶液至干，殘留物加入甲醇溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液。按牡丹花粉口含片處方及工藝制備缺牡丹花粉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的芍藥苷對(duì)照品溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[10]進(jìn)行試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40 ∶ 5 ∶ 10 ∶ 0.2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，105 ℃烘烤至斑點(diǎn)顯色清晰，置于日光燈下檢視。結(jié)果，在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1。

2.2.2 山柰酚和木犀草素 取牡丹花粉口含片適量，研缽研細(xì)，稱取粉末10 g，加入70%乙醇溶液100 mL，加熱回流1.5 h，濾過，重復(fù)2次，合并濾液，蒸干；殘留物用30 mL水溶解后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯各30 mL振搖萃取。將乙酸乙酯萃取液減壓蒸干，殘留物用甲醇30 mL溶解，再加入25%鹽酸溶液5 mL，90 ℃水浴水解2 h，蒸干并加入20 mL水溶解殘留物，溶解液用乙酸乙酯30 mL振搖萃取2次，萃取液減壓蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按牡丹花粉口含片處方及工藝制成缺少牡丹花粉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。取山柰酚、木犀草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制備成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的山柰酚、木犀草素對(duì)照品溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[10]進(jìn)行試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（8.5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出晾干，噴以1%三氯化鋁-乙醇溶液，60～70 ℃烘烤至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈下（波長365 nm）檢視。結(jié)果，在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖2。

2.3 雙波長-HPLC法測定牡丹花粉口含片中芍藥苷和氧化芍藥苷含量

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷和氧化芍藥苷對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備成芍藥苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度分別為0.24、0.34 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取芍藥苷貯備液3 mL、氧化芍藥苷貯備液0.8 mL，置于同一5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制備成芍藥苷和氧化芍藥苷質(zhì)量濃度分別為144、54.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 取牡丹花粉口含片適量，研缽研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入50%乙醇溶液20 mL，稱定其質(zhì)量，超聲提?。üβ剩?50 W，頻率：40 kHz）1 h，靜置放冷，再次稱定其質(zhì)量，以50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心 （4 000 r/min）5 min，取上清液置于50 mL量瓶中，然后用50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按牡丹花粉口含片處方及工藝制備缺牡丹花粉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫 （0～8 min，12%A；8～20 min，18%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：230 nm（芍藥苷）、258 nm（氧化芍藥苷）；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，樣品中芍藥苷和氧化芍藥苷的色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論板數(shù)以芍藥苷計(jì)不低于3 000，色圖譜見圖3。

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 mL，分別置于1 mL量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液（12 ∶ 88，V/V）定容，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、芍藥苷或氧化芍藥苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到芍藥苷和氧化芍藥苷的線性回歸方程分別為y=26.154 4x+14.505 7（r=0.999 8）和y=25.540 6x+ 0.536 9（r=0.999 7）。結(jié)果表明，芍藥苷、氧化芍藥苷的檢測質(zhì)量濃度分別在7.2～86.4、2.72～32.64 μg/mL范圍內(nèi)與其各自的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 定量限與檢測限 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。按信噪比為10 ∶ 1計(jì)算定量限，按信噪比為3 ∶ 1計(jì)算檢測限。結(jié)果顯示，氧化芍藥苷與芍藥苷的定量限分別為47.6、33.7 ng，檢測限分別為18.1、 7.6 ng。

2.3.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液（芍藥苷、氧化芍藥苷的質(zhì)量濃度分別為43.2、16.32 μg/mL）20 μL，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，測得芍藥苷和氧化芍藥苷峰面積的RSD分別為1.33%、1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一牡丹花粉口含片（批號(hào)：2018103001）樣品粉末2 g，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后，分別按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，測得芍藥苷和氧化芍藥苷峰面積的RSD分別為1.03%、1.07%（n=8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一牡丹花粉口含片（批號(hào)：2018103001）樣品粉末2 g ，共6份，精密稱定，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，再按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，測得芍藥苷、氧化芍藥苷的平均含量分別為1.265 7、0.415 6 mg/g，RSD分別為2.48%、1.97%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的牡丹花粉口含片（批號(hào)：2018103001）樣品1 g，共6份，精密稱定，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入適量的芍藥苷、氧化芍藥苷混合對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，芍藥苷和氧化芍藥苷的平均加樣回收率分別為99.12%、98.65%，RSD分別為1.54%、2.53%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表1。

2.3.12 含量測定 精密稱取3批不同批號(hào)的牡丹花口含片粉末2 g，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各3份，然后按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷和氧化芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC條件的選擇

本研究參考2015年版《中國藥典》（一部）赤芍項(xiàng)下芍藥苷的TLC鑒別條件[2]，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40 ∶ 5 ∶ 10 ∶ 0.2，V/V/V/V）作為展開系統(tǒng)并進(jìn)行優(yōu)化，建立了該產(chǎn)品中單萜苷類成分芍藥苷的定性鑒別方法，其薄層色譜斑點(diǎn)清晰，特征明顯，陰性無干擾。另外，筆者參考文獻(xiàn)[11-13]比較了三氯甲烷-甲醇-甲酸、乙酸乙酯-石油醚（30～60 ℃）-甲酸和甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇3種展開系統(tǒng)對(duì)黃酮類成分山柰酚和木犀草素的展開效果，發(fā)現(xiàn)以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇為展開系統(tǒng)時(shí)可對(duì)該產(chǎn)品中山柰酚和木犀草素2種成分進(jìn)行同時(shí)鑒別。通過對(duì)展開系統(tǒng)的優(yōu)化現(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（8.5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V/V）在紫外光燈（波長365 nm）下，其薄層色譜斑點(diǎn)清晰，特征明顯，重復(fù)性好，陰性對(duì)照無干擾。

3.2 含量測定波長的選擇

參考文獻(xiàn)方法[14-18]，充分考慮芍藥苷在230 nm處有較強(qiáng)吸收、氧化芍藥苷在258 nm處有較強(qiáng)吸收，建立了雙波長-HPLC法同時(shí)測定牡丹花粉口含片中芍藥苷、氧化芍藥苷含量，保證了其在最大吸收波長處檢測，且峰形對(duì)稱，分離度良好。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

在前期研究中，筆者曾以芍藥苷和氧化芍藥苷的含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對(duì)牡丹花粉口含片的提取方法（超聲提取、回流提?。⑻崛∪軇ㄋ?、50%甲醇、50%乙醇、70%乙醇）、提取時(shí)間（0.5、1、2 h）等進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)以50%乙醇為溶劑超聲提取1 h可以將樣品中的芍藥苷和氧化芍藥苷充分提取出來，故將該方法作為供試品的制備方法。

綜上所述，本研究建立的TLC法斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無干擾；建立的同時(shí)測定牡丹花粉口含片中芍藥苷、氧化芍藥苷含量的雙波長-HPLC法，準(zhǔn)確性好、靈敏度高，能客觀反映該口含片的內(nèi)在質(zhì)量，可以作為牡丹花粉口含片的質(zhì)量控制手段之一。

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（收稿日期：2018-12-17 修回日期：2019-02-14）

（編輯：林 靜）