楚冬海 張振秋

摘 要 目的：研究瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：以采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）為化學(xué)缺氧劑，建立大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，篩選不同濃度Na2S2O4（0.625～10 mmol/L）和不同缺氧時(shí)間（10～60 min）、復(fù)氧時(shí)間（2～8 h）的造模條件，以及瓜蔞皮提取物給藥濃度（12.5～400 μg/mL）。將細(xì)胞分為正常組、模型組、瓜蔞皮提取物不同劑量組（即TPE低、中、高劑量組，25、50、100 μg/mL）和陽(yáng)性對(duì)照組（槲皮素，25 μmol/L），加入相應(yīng)藥物進(jìn)行預(yù)處理24 h后，再建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況；采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷造模條件為Na2S2O4造模濃度2.5 mmol/L，缺氧時(shí)間30 min，復(fù)氧時(shí)間4 h；12.5～400 μg/mL的瓜蔞皮提取物對(duì)細(xì)胞均無(wú)毒性。分組處理后結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高，細(xì)胞中CK-MB、LDH、MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低，Bax的蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，瓜蔞皮提取物各劑量組細(xì)胞上述變化均被逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用；其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加、提高細(xì)胞清除活性氧自由基的能力、上調(diào)Bcl-2/下調(diào)Bax蛋白表達(dá)等，從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 瓜蔞皮；連二亞硫酸鈉；缺氧/復(fù)氧損傷；心肌細(xì)胞；機(jī)制

Study on Protective Effects of Pericarpium Trichosanthis Extract on H9c2 Myocardial Cells Injured by Hypoxia/Reoxygenation and Its Mechanism

CHU Donghai1，ZHANG Zhenqiu2（1. School of Biomedical and Chemical Engineering， Liaoning Institute of Science and Technology， Liaoning Benxi 117004， China； 2. Pharmacy College， Liaoning University of TCM， Liaoning Dalian 116600， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Pericarpium Trichosanthis extract（TPE） on H9c2 myocardial cells injured by hypoxia/reoxygenation（H/R）. METHODS： H/R injury model of H9c2 myocardial cells was established by using sodium dithionite （Na2S2O4） as chemical hypoxia agent. The modeling conditions of different concentrations of Na2S2O4 （0.625-10 mmol/L） and different time of hypoxia （10-60 min） and reoxygenation （2-8 h）， as well as the concentration of TPE （12.5-400 μg/mL） were screened. The cultured H9c2 myocardial cells were randomly divided into normal group， model group， TPE different dose groups （TPE low-dose， medium-dose and high-dose groups， 25， 50， 100 μg/mL） and positive control group （quercetin， 25 μmol/L）. They were pre-treated with relevant medicine for 24 h， and then H/R injury model was established. Cell viability was measured by MTT assay. The levels of LDH， CK-MB， SOD and MDA in cells were tested by ELISA. Apoptosis of H9c2 myocardial cells were observed by flow cytometry. Western blotting was used to detect the protein expression of Bax and Bcl-2 in cells. RESULTS： The condition of H/R injury modeling included modeling concentration of Na2S2O4 2.5 mmol/L， hypoxia time 30 min， reoxygenation time 4 h. 12.5-400 μg/mL TPE showed no toxicity to H9c2 myocardial cells. After treatment， compared with blank group， survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells in model group were increased significantly； the levels of CK-MB， LDH and MDA were increased significantly， while SOD level was decreased significantly； protein expression of Bax and Bax/Bcl-2 ratio were increased significantly， while that of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above changes of H9c2 myocardial cells were reversed in all dose groups of TPE （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TPE can protect H9c2 myocardial cells against H/R injury. Its mechanism may be associated with inhibiting the increase of lipid peroxide， improving the ability of scavenging reactive oxygen free radicals， up-regulating the protein expression of Bcl-2 or down-regulating protein expression of Bax， so as to inhibit the cell apoptosis.

KEYWORDS Pericarpium Trichosanthis； Sodium hydrosulfite； Hypoxia/reoxygenation injury； Myocardial cells； Mechanism

冠心病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病[1]；其癥狀之一是心絞痛，即主要由心肌缺血、缺氧引起的發(fā)作性胸痛或胸部不適[1-2]?！吨袊?guó)心血管病報(bào)告2017》指出，冠心病占我國(guó)城鄉(xiāng)居民死亡因素的第3位，預(yù)計(jì)到2030年，其有可能成為人類(lèi)死亡的首位原因，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康[3]。因此，臨床上亟需有效的冠心病防治藥物。

瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxiam.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果皮，具有清熱化痰、利氣寬胸的功效，可用于治療痰熱咳嗽、胸悶脅痛[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，瓜蔞皮具有抗心腦血管疾病、抗腫瘤、抗菌、抗氧化及抗?jié)兊茸饔肹5-6]。本研究以連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）作為化學(xué)缺氧劑建立大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，探討瓜蔞皮提取物對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為瓜蔞皮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；MR18.22型超速低溫離心機(jī)（法國(guó)Jouan公司）；CP225D型微量電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；FACSVerse型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；JY200C型電泳儀（北京君意電泳設(shè)備有限公司）；Tanon-5200型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥材、藥品及試劑

瓜蔞皮藥材收集于河北省安國(guó)市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）的干燥成熟果皮；槲皮素對(duì)照品[中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：00081- 200907，純度（高效液相色譜法）：≥98%]；Na2S2O4（美國(guó)百靈威科技有限公司，純度：85%）；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（上海聯(lián)碩科技有限公司，批號(hào)均為201804）；兔抗大鼠Bax抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體、GAPDH抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)均為BC18AA0047）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）、牛血清白蛋白（BSA）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為B0802、P2300）；MTT、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；1%青霉素-鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）（美國(guó)Hyclone公司）；細(xì)胞裂解液、動(dòng)物全蛋白提取試劑盒、動(dòng)物全蛋白提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；PVDF膜（美國(guó)Merck Millipore公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠子一代H9c2心肌細(xì)胞，購(gòu)于上海子實(shí)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥材提取及溶液配制

2.1.1 瓜蔞皮提取物的制備與溶液配制 稱(chēng)取干燥瓜蔞皮粉末100 g，加水1 000 mL浸泡30 min，煎煮2 h，8層紗布過(guò)濾[7-8]；濾渣同法重復(fù)提取2次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，再經(jīng)真空冷凍干燥，即得瓜蔞皮提取物（得率為19.5%），于4 ℃保存、備用。精密稱(chēng)取瓜蔞皮提取物20.0 mg，以DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“培養(yǎng)基”）溶解制成2.0 mg/mL的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，于4 ℃保存。后續(xù)試驗(yàn)時(shí)以培養(yǎng)基將其稀釋至相應(yīng)濃度。

2.1.2 Na2S2O4溶液的配制 精密稱(chēng)取Na2S2O4 30.72 mg，以PBS溶解制成10 mmol/L的貯備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。后續(xù)試驗(yàn)時(shí)以PBS將其稀釋至相應(yīng)濃度，避光使用 。

2.1.3 槲皮素溶液的配制 精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品3.0 mg，加入DMSO 5 μL溶解，再加入培養(yǎng)基稀釋制成2.5 mmol/L的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，于4 ℃保存。后續(xù)試驗(yàn)時(shí)以培養(yǎng)基將其稀釋至相應(yīng)濃度。

2.1.4 MTT溶液的配制 取MTT 0.5 g，加入PBS溶解制成5 mg/mL的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，于4 ℃避光保存。后續(xù)試驗(yàn)時(shí)以培養(yǎng)基將其稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取H9c2心肌細(xì)胞，用含10%FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“完全培養(yǎng)液”）于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），適時(shí)換液。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，即可進(jìn)行傳代。傳代至第5代時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。在每次試驗(yàn)前，吸棄原培養(yǎng)液，換用含0.5%FBS、1%雙抗的培養(yǎng)基“饑餓”細(xì)胞12 h，進(jìn)行同步化處理[9]。

2.3 造模濃度及給藥濃度的篩選

2.3.1 Na2S2O4造模濃度及缺氧、復(fù)氧時(shí)間篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1～2次。將細(xì)胞分為正常組和模型組，正常組加入培養(yǎng)液，模型組分別加入不同濃度的Na2S2O4溶液（終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L），每孔100 μL，分別培養(yǎng)10、20、30、40、60 min使細(xì)胞缺氧。吸棄含Na2S2O4的培養(yǎng)液，換新鮮完全培養(yǎng)液后于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)4、8 h使細(xì)胞復(fù)氧[10-11]。培養(yǎng)結(jié)束后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，渦旋振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解；用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。另設(shè)空白組，除不加入細(xì)胞、Na2S2O4外，其余操作相同。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。根據(jù)下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（A模型組-A空白組）/ （A正常組-A空白組）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.2 瓜蔞皮提取物給藥濃度篩選 按“2.3.1”項(xiàng)下方法接種并培養(yǎng)細(xì)胞，分為正常組、陽(yáng)性對(duì)照組和瓜蔞皮提取物組，分別加入培養(yǎng)液、槲皮素溶液（終濃度為25 μmol/L）和瓜蔞皮提取物溶液（終質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），培養(yǎng)24 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.3.1”項(xiàng)下“每孔細(xì)胞加入5 mg/mLMTT溶液20 μL……”開(kāi)始操作，以MTT法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（A藥物組-A空白組）/（A正常組-A空白組）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞分組、給藥預(yù)處理及造模

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以PBS洗滌1～2次，隨機(jī)分為正常組，模型組，瓜蔞皮提取物不同劑量組（即TPE低、中、高劑量組）和陽(yáng)性對(duì)照組。正常組和模型組均加入完全培養(yǎng)液，TPE各劑量組分別加入瓜蔞皮提取物溶液（終質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL），陽(yáng)性對(duì)照組加入槲皮素溶液（終濃度為25 μmol/L），培養(yǎng)24 h進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，除正常組外，其余各組均加入Na2S2O4溶液（終濃度為2.5 mmol/L）培養(yǎng)30 min使細(xì)胞缺氧；吸棄含Na2S2O4培養(yǎng)液，換新鮮的完全培養(yǎng)液后培養(yǎng)4 h，使細(xì)胞復(fù)氧。

2.5 各組細(xì)胞活力考察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、給藥預(yù)處理及造模。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧后，參照“2.3.2”項(xiàng)下MTT法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率，用來(lái)考察細(xì)胞活力。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 各組細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況[12]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、給藥預(yù)處理及造模。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧后，以0.25%胰蛋白酶（不含0.02%EDTA）消化處理細(xì)胞，PBS洗滌2次，以1×Binding Buffer重懸并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL至流式上樣管，加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕搖勻，室溫下避光孵育5 min；再加入碘化丙啶5 μL，室溫下避光孵育5 min；加PBS至500 μL，搖勻，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 各組細(xì)胞中LDH、CK-MB、SOD、MDA水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)[13]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于24孔板，每孔0.5 mL。按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組、給藥預(yù)處理及造模。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧后，按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH、CK-MB、SOD、MDA水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)[14]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥預(yù)處理及造模。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。復(fù)氧后，采用動(dòng)物全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白24 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%BSA封閉30 min后，分別加入Bax抗體、Bcl-2抗體、內(nèi)參GAPDH抗體（1 ∶ 5 000），于4 ℃靜置12 h；TBST洗滌2次，加入二抗（1 ∶ 10 000），室溫?fù)u床孵育2 h；采用ECL試劑盒曝光顯色，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以Image J 1.46r 軟件分析目的蛋白條帶的相對(duì)灰度值，用來(lái)表示其表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，以x±s表示，采用GraphPad Prism5.0軟件繪制柱形圖；多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Na2S2O4造模濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，細(xì)胞活力隨Na2S2O4濃度升高和缺氧時(shí)間增加而降低；復(fù)氧時(shí)間超過(guò)4 h后，細(xì)胞活力降低，存活率顯著下降。綜合考慮后，確定細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷造模條件為：Na2S2O4造模濃度為2.5 mmol/L，缺氧時(shí)間為30 min，復(fù)氧時(shí)間為4 h。不同濃度Na2S2O4及不同缺氧、復(fù)氧時(shí)間條件下細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1。

3.2 瓜蔞皮提取物給藥濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，12.5～400 μg/mL的瓜蔞皮提取物處理24 h，細(xì)胞存活率均大于85%，無(wú)明顯毒性作用；其中，50、100 μg/mL的瓜蔞提取物對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定促進(jìn)作用[細(xì)胞存活率分別為（104.8±1.1）%、（105.3±1.7）%]，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇25、50、100 μg/mL作為低、中、高劑量。不同質(zhì)量濃度瓜蔞皮提取物作用24 h時(shí)細(xì)胞存活率見(jiàn)圖2。

3.3 瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞活力的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞存活率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.4 瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞凋亡的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組細(xì)胞的流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖4，凋亡率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.5 瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞中LDH、CK-MB水平的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中LDH、CK-MB水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中LDH、CK-MB水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組細(xì)胞中LDH、CK-MB水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.6 瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞中SOD、MDA水平的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中SOD水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中SOD、MDA水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。

3.7 瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞的Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax的蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Bax的蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax的蛋白電泳圖見(jiàn)圖8，蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

4 討論

心肌缺血、缺氧可導(dǎo)致心肌代謝功能異常和結(jié)構(gòu)破壞，從而引發(fā)胸痛或胸部不適，屬中醫(yī)“胸痹”“真心痛”的范疇[1]。臨床上主要采用藥物治療法、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等進(jìn)行治療，但在心肌血流恢復(fù)的同時(shí)，由于氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌凋亡通路激活，可能會(huì)加重心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷，即心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）[2，15]。誘發(fā)MI/RI的原因較復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣超載和能量代謝等[16]，故目前尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的治療方法。因此，尋找有效的藥物來(lái)預(yù)防和治療心肌缺血性疾病有著重要的意義。

瓜蔞皮富含黃酮、多糖、氨基酸及蛋白質(zhì)等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及提升免疫力等作用，能夠多靶點(diǎn)地整體協(xié)同發(fā)揮作用，在治療冠心病方面具有一定優(yōu)勢(shì)[17-18]。研究證實(shí)，黃酮類(lèi)化合物槲皮素能夠預(yù)防冠心病、高血壓、糖尿病及多種腫瘤的發(fā)生，并且具有抗菌、抗病毒活性[19]。因此，本研究選用槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

Na2S2O4的耗氧能力與其濃度呈正相關(guān)，其耗氧反應(yīng)過(guò)程為：Na2S2O4+O2+H2O→NaHSO4+NaHSO3[20]。研究報(bào)道，以2 mmol/L Na2S2O4溶液處理可使細(xì)胞保持無(wú)氧狀態(tài)達(dá)1 h，且未造成細(xì)胞膜損傷，可用于制造細(xì)胞的缺氧液相環(huán)境；缺氧結(jié)束后更換培養(yǎng)液，則可恢復(fù)細(xì)胞正常供氧，實(shí)現(xiàn)復(fù)氧[21]。因此，本研究采用Na2S2O4為化學(xué)耗氧劑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧。經(jīng)造模濃度及作用時(shí)間的篩選試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，隨著Na2S2O4濃度增大及缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低；Na2S2O4濃度及缺氧時(shí)間一定時(shí)，細(xì)胞存活率隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；當(dāng)缺氧時(shí)間為20～40 min、復(fù)氧時(shí)間為8 h時(shí)，細(xì)胞存活率下降趨勢(shì)更加明顯。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)并結(jié)合Na2S2O4實(shí)際應(yīng)用情況[22]，本研究選擇2.5 mmol/L的Na2S2O4進(jìn)行缺氧30 min、復(fù)氧4 h處理，以建立H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型。

篩選瓜蔞皮提取物預(yù)處理濃度的結(jié)果顯示，12.5～400 μg/mL瓜蔞皮提取物預(yù)處理24 h對(duì)心肌細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用。經(jīng)25、50、100 μg/mL的瓜蔞皮提取物預(yù)處理后，細(xì)胞的存活率均大于85%。

CK-MB和LDH是兩種重要的心肌酶，其水平高低即釋放量的多少可反映細(xì)胞的受損情況[17]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧處理后細(xì)胞中CK-MB、LDH水平均顯著上升；而經(jīng)瓜蔞皮提取物預(yù)處理可使其水平顯著降低，表明該提取物能減輕細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

細(xì)胞缺氧后，細(xì)胞能量代謝紊亂，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變；復(fù)氧時(shí)，活性氧自由基大量生成并堆積，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[18]。MDA是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映細(xì)胞受氧自由基損害的程度；SOD作為廣泛存在于生物體的內(nèi)源性抗氧化酶，具有抗氧化、抗炎及抗衰老作用，其活性水平可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，并間接反映機(jī)體保護(hù)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的能力[17]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧造模后細(xì)胞中MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低；而經(jīng)瓜蔞皮提取物預(yù)處理可使MDA水平顯著下降，SOD水平顯著上升。這表明瓜蔞皮提取物能提高細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而減輕細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的重要指標(biāo)之一，其受到多種蛋白分子的調(diào)節(jié)，包括促凋亡蛋白（如Bax、Bad等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等）。Bcl-2可通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生、降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、減少鈣超載等抑制細(xì)胞凋亡；Bax則具有相反的功能[23]。有學(xué)者提出，Bax/Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的“開(kāi)關(guān)”，二者比值的升高/降低標(biāo)志著細(xì)胞凋亡過(guò)程的激活/抑制[23]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中Bax的蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高；而上述變化可被瓜蔞皮提取物逆轉(zhuǎn)。這表明瓜蔞皮提取物減輕細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用可能與其抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

在上述指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)中劑量瓜蔞皮提取物（50 μg/mL）對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)，其對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善作用較之于高劑量（25 μg/mL）更明顯?？紤]到本研究采用的瓜蔞皮提取物屬于混合物，沒(méi)有經(jīng)過(guò)分離純化，其含有的化學(xué)成分類(lèi)型比較復(fù)雜，中劑量提取物中含有的特征化學(xué)成分可能針對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷模型細(xì)胞發(fā)揮了最大的藥物保護(hù)作用，而高劑量提取物可能由于某些化學(xué)成分含量過(guò)高而引發(fā)負(fù)反饋?zhàn)饔茫瑢?dǎo)致其保護(hù)效果下降。因此，在后續(xù)研究中擬進(jìn)一步分離純化并確證瓜蔞皮提取物中的具體成分，以確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，瓜蔞皮提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。該作用可能通過(guò)抑制細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加、提高其清除活性氧自由基的能力、上調(diào)Bcl-2/下調(diào)Bax蛋白表達(dá)等機(jī)制，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。瓜蔞皮中的具體功效物質(zhì)基礎(chǔ)是下一步的研究重點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-11-04 修回日期：2019-03-11）

（編輯：段思怡）