王兆飛 管世鶴 陳禮文 楊凱 張浩 候舒文 潘正蘭 段元麗 王秀

摘要：目的 初步探究鐵調(diào)素抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法 使用鐵調(diào)素處理pcDNA1.3轉(zhuǎn)染的HepG2細胞及pSM2轉(zhuǎn)染的Huh7細胞，檢測并分析不同時間點鐵調(diào)素處理組與未處理組之間培養(yǎng)上清液中HBV-DNA、HBeAg水平的差異。結(jié)果 與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細胞鐵調(diào)素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05），pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細胞鐵調(diào)素處理組HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）。與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細胞鐵調(diào)素處理組HBeAg表達顯著降低（P<0.05），pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細胞鐵調(diào)素處理組HBeAg表達顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 通過研究我們初步證明了鐵調(diào)素具有一定的抑制HBV復制的活性。

關(guān)鍵詞：肝炎病毒，乙型;鐵調(diào)素;HepG2細胞;Huh7細胞

鐵調(diào)素（Hepcidin）是一種由肝臟合成并分泌富含半胱氨酸的生物活性多肽，由于鐵調(diào)素在體外研究過程中表現(xiàn)出明顯的抗菌活性屬于高度保守的防御性多肽，作為一種陽離子抗菌多肽鐵調(diào)素也被稱為肝臟抗菌多肽（LEAP-1）。鐵調(diào)素除在維持鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用外還具有一定的抗菌活性，既往對鐵調(diào)素的抗菌活性研究中我們發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素通過限制細胞外鐵得獲得，一些細胞以這種“營養(yǎng)免疫”的形式對抗細菌感染。近期另一些研究提出，鐵調(diào)素具有不依賴于以往“營養(yǎng)免疫”的形式而獨立影響免疫應答的作用[1]。然而在目前沒有體內(nèi)研究結(jié)論支持的情況下，一些研究報道鐵調(diào)素可能通過一種尚未被充分了解的機制抑制炎性細胞因子。然而鐵調(diào)素在宿主防御中具有獨立作用都僅是推測性的結(jié)論。近期有學者報道體內(nèi)常量鐵調(diào)素未能表現(xiàn)出顯著的免疫學活性，而高濃度鐵調(diào)素（濃度為體內(nèi)常量的數(shù)十倍）在體外細胞實驗中表現(xiàn)出一定的免疫學活性[2，3]。并有研究報道體外細胞實驗中高濃度鐵調(diào)素可以抑制HCV/HIV病毒復制[4]，而鐵調(diào)素能否同樣影響HBV的復制仍未有提及。為此，本課題通過探究高濃度鐵調(diào)素對HBV病毒復制的影響，從而明確應用鐵調(diào)素治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床價值。

1 研究對象與方法

1.1 儀器與試劑 低溫高速離心機;超低溫冰箱;HBV-DNA病毒定量檢測試劑盒（批號：20180512 R1）;雅培全自動化學發(fā)光免疫分析儀（i2000SR）;

1.2 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染? 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM對HepG2細胞、Huh7細胞（上海富亨細胞庫）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，調(diào)整每孔細胞數(shù)約為1×106。取具備乙型肝炎病毒全基因組的pC1.3質(zhì)粒（pSM2）1.8 μg，混合脂質(zhì)載體（Thermo Scientific，USA）2μL，靜置20 min，轉(zhuǎn)染接種于6孔板24 h，繼續(xù)培養(yǎng)細胞達到80%融合;在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)定12h、24h、48h取細胞上清液。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析。應用 Kolmogorov-Smirnov檢驗對定量資料進行正態(tài)分布檢驗，應用Spearman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 鐵調(diào)素處理組與未處理不同時間點HBV DNA水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細胞鐵調(diào)素處理組在12h時即出現(xiàn)HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2A所示。

與未處理組比較，pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細胞鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBV DNA水平的下降，在處理48h時HBV DNA水平顯著降低（P<0.05）如圖2B所示。

2.2 鐵調(diào)素處理組與未處理不同時間點HBeAg水平的比較

與未處理組比較，pcDNA1.3轉(zhuǎn)染HepG2細胞鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBeAg表達的下降，在處理48h時HBeAg表達顯著降低（P<0.05）如圖3A所示。

與未處理組比較，pSM2轉(zhuǎn)染Huh7細胞HBeAg鐵調(diào)素處理組在24h時即出現(xiàn)HBeAg表達的下降，在處理48h時HBeAg表達顯著降低（P<0.05）如圖3B所示。

4 討論

據(jù)既往研究報道鐵調(diào)素在體外實驗中表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，并且鐵調(diào)素的抗菌活性與它的生理活性相關(guān)，具體機制為鐵調(diào)素通過降鐵作用導致體內(nèi)鐵元素的低水平，低鐵環(huán)境使得細菌生長繁殖受到這種“鐵營養(yǎng)”缺乏的影響，表現(xiàn)出抑制細菌生長繁殖的活性。所以最初鐵調(diào)素抗菌活性正是依靠這種營養(yǎng)性免疫的形式實現(xiàn)的。所以在感染性疾病中鐵調(diào)素扮演的角色仍存在爭議。近期研究發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素在HCV及HIV感染過程中表達受到顯著抑制，在體外實驗中鐵調(diào)素可以抑制Huh7細胞中HCV病毒的復制[5]，此外在HIV感染的過程中鐵調(diào)素的早期表達對于隨后的病毒載量有著密切聯(lián)系，但是這種相關(guān)機制尚未明確。于是我們對鐵調(diào)素影響HBV復制進行了初步研究。

我們通過模擬HBV感染肝細胞對肝炎、肝癌體外細胞系進行HBV病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，并以高濃度的鐵調(diào)素加以處理，通過定時測定培養(yǎng)上清液HBeAg、HBV DNA表達水平來了解鐵調(diào)素對HBV復制的影響，本研究發(fā)現(xiàn)在鐵調(diào)素的作用下HBV的復制受到顯著抑制。結(jié)合國內(nèi)外的研究我們對鐵調(diào)素抑制HBV復制的具體機制進行了推測，據(jù)國外學者對鐵調(diào)素抗HCV活性研究的過程中發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素的抗病毒活性可能與其對肝細胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)的影響相關(guān)。在鐵調(diào)素處理的肝細胞中IFN的表達不是定向的，但是在鐵調(diào)素的作用下肝細胞中一些IFN誘導基因的表達顯著上調(diào)，如OAS1和IFIT1（ISG56）。其中已知的IFIT1是影響細胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)中的重要蛋白質(zhì)，而鐵調(diào)素刺激上調(diào)的IFIT1可能直接參與了鐵調(diào)素介導的抗病毒作用。另外，高水平鐵調(diào)素可直接導致體內(nèi)的低鐵環(huán)境，并通過這種營養(yǎng)限制的方式導致病毒在胞內(nèi)的復制繁殖過程受阻，從而表現(xiàn)出對病毒復制抑制效應。以上兩點皆是我們對鐵調(diào)素抗HBV活性具體機制的推測，然而由于鐵調(diào)素對機體免疫反應的復雜作用，所以這種抗HBV活性的具體機制需要進一步探究。我們的研究初步證明了鐵調(diào)素具有一定的抑制HBV復制的活性，也進一步佐證了應用鐵調(diào)素對于治療慢性乙型病毒肝炎的臨床價值。

基金：安徽省科技廳重點研究與開發(fā)計劃項目（1804h08020236）;安徽省高校自然科學研究項目（KJ2018A0206）;安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院首批“火花計劃”科研項目（2015hhjh06）

參考文獻：

[1]Sow FB，F(xiàn)lorence WC，Satoskar AR，Schlesinger LS，Zwilling BS，Lafuse WP. Expression and localization of hepcidin in macrophages：a role in host defense against tuberculosis. Journal of LeukocyteBiology. 2007;82（4）：934–45.

[2]Peyssonnaux C，Zinkernagel AS，Datta V，Lauth X，Johnson RS，Nizet V. TLR4-dependent hepcidin expression by myeloid cells in response to bacterial pathogens. Blood. 2006;107（9）：3727–32.

[3]Hunter HN，F(xiàn)ulton DB，Ganz T，Vogel HJ. The solution structure of human hepcidin，apeptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. Journal of Biological Chemistry. 2002;277（40）：37597–603.

[4] Lambrecht RW，Sterling RK，Naishadham D，Stoddard AM，Rogers T，Morishima C，et al. Iron levels in hepatocytes and portal tract cells predict progression and outcomes of patients with advanced chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2011;140（5）：1490–500.

[5] Liu H，Trinh T L，Dong H，et al. Iron Regulator Hepcidin Exhibits Antiviral Activity against Hepatitis C Virus. PLoS ONE，2012，7（10）：e46631.

作者簡介：

王兆飛，男，碩士研究生;單位：安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 檢驗科，合肥230601

管世鶴，男，教授，主任技師，博士生導師，責任作者，單位：安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 檢驗科，合肥230601，E-mail：shiheguan@126.com。