吳俐 湯葆莎 賴譜富 李怡彬 翁敏劼 陳君琛

摘 要：【目的】優(yōu)化黑木耳糖醛酸提取工藝，提高黑木耳資源的開發(fā)、應(yīng)用價值?！痉椒ā客ㄟ^比較熱水、超聲波、微波、光波、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等方法的黑木耳糖醛酸提取率，得到最佳提取方法;通過單因素試驗比較黑木耳粒徑、果膠酶添加量、液料比、提取溫度、提取時間、pH值、超聲功率、超聲時間等對黑木耳糖醛酸提取率的影響，得到關(guān)鍵影響因素;在單因素實驗基礎(chǔ)上，以液料比、提取溫度、超聲功率和pH值為自變量，利用4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳糖醛酸提取工藝?！窘Y(jié)果】超聲波、微波、光波等3種物理破壁方法和中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等3種生物酶法中分別以超聲波法和果膠酶法最佳;單因素提取黑木耳糖醛酸的最佳條件分別為：黑木耳粒徑58 μm、果膠酶0.25%、液料比100? mL·g-1、提取溫度50℃、提取時間2 h、pH值5.50、超聲功率540 W、超聲時間30 min;確定響應(yīng)面最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比110? mL·g-1、pH5.60、超聲功率540 W、提取溫度49℃。本研究在超聲波協(xié)同果膠酶提取黑木耳糖醛酸的最佳條件下，糖醛酸提取率達(dá)7.95‰，比傳統(tǒng)熱水法提高了201%?！窘Y(jié)論】通過超聲波與果膠酶協(xié)同提取超微粉碎的黑木耳粉的糖醛酸工藝，確定響應(yīng)面最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比110? mL·g-1、pH5.60、超聲功率540 W、提取溫度49℃。

關(guān)鍵詞：黑木耳;糖醛酸;超聲波;果膠酶;工藝優(yōu)化

中圖分類號：S 646.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）06-719-11

Abstract： 【Objective】To improve the development and application value of resourcos of? Auricularia auricula （L. ex Hook） Underw，extraction process of uronic acid from Auricularia auricula （L. ex Hook） Underw was optimized. 【Method】By comparing the uronic acid yield， applications of ultrasound， microwave， light， neutral protease， cellulase， and/or pectinase were incorporated in the extraction to maximize the production. Critical processing conditions including substrate particle size， pectinase dosage， solvent to substrate ratio， temperature， time， pH， ultrasonic power， and ultrasound application time were evaluated in a single factor test. The ultrasound-assisted process with added pectinase was selected for the process optimization using the response surface method with 4 factors and 3 levels. 【Result】The optium method for extracting uronic acid from A.auricula were ultrasound and pectinase. The optimum extraction conditions were determined to include the substrate particle size of 58 μm， pectinase addition at 0.25%， solvent to substrate ratio at 100 mL·g-1， temperature at 50℃， 2 h process duration， pH at 5.50， and 540 W ultrasonic treatment for 30 min. The response surface experiment indicated that a solvent to substrate ratio of 110 mL·g-1， pH at 5.60， ultrasonic power of 540 W， and temperature at 49℃ would maximize the uronic acid yield at 7.95‰， which was 201% of what a traditional hot water method delivered. 【Conclusion】The newly established highly efficient process to extract uronic acid from ultra-fine A. auricula powder applied 540 W ultrasound， added pectinase， used 110 mL per gram of substrate， adjusted pH to 5.60， and maintained a temperature at 49℃ throughout the process，which optimized the extration process of uronic acid of A.auricula，improved the economic value and provided reference for exploiting resources of A.auricula.

Key words： Auricularia auricular; uronic acid; ultrasound; pectinase; process optimization

0 引言

【研究意義】黑木耳Auricularia auricula（L. ex Hook） Underw.又稱木耳、云耳、木蛾、黑菜、榆耳，是一種藥食兼用膠質(zhì)菌，在我國已有1 000多年的栽培史[1-2]。國內(nèi)外大量體外試驗[3-4]、動物試驗[5-8]、人體觀察試驗[9-10]研究表明黑木耳多糖具有明顯的降血脂[11-12]和抗血栓形成的作用，是良好的膳食補(bǔ)充資源。黑木耳多糖的化學(xué)組成中含有葡萄糖醛酸（GlcUA）[13]，糖醛酸不以游離單糖存在，而是以苷或多糖的形態(tài)存在，成為膠質(zhì)或黏液物質(zhì)的主要成分[14]，糖醛酸可通過促進(jìn)膽固醇代謝達(dá)到降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的作用;同時糖醛酸含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)[15-16]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黑木耳細(xì)胞壁厚且堅韌，質(zhì)地致密的結(jié)構(gòu)特性阻礙糖醛酸成分溶出，破碎黑木耳細(xì)胞壁，對提高消化吸收率、提高活性具有十分重要的意義。目前常用物理破壁方法有超微粉碎[6，17]、超聲波[18-19]和微波[20-21]輔助提取技術(shù)等，而化學(xué)方法包括生物酶法[18，20，22]提取等。楊春瑜等[23]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳超微粉碎可以使黑木耳多糖提取率提高3.6%。徐思綺等[24]研究熱水發(fā)現(xiàn)浸提法、堿提取法和纖維素酶提取法等得到的非淀粉多糖中糖醛酸的含量、抗氧化和降血糖能力存在較大的差異，糖醛酸含量以堿提法最高，達(dá)0.24%，抗氧化能力最強(qiáng)。超微粉碎使物料粒徑達(dá)到微米級別，可促進(jìn)黑木耳糖醛酸的溶出。超聲波是一種機(jī)械波，在彈性介質(zhì)中傳播，振動頻率高于20 000 Hz。利用超聲波的機(jī)械作用、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)使細(xì)胞組織變形、蛋白質(zhì)變性，細(xì)胞壁破裂，加速有效成分進(jìn)入溶劑進(jìn)而增加黑木耳糖醛酸提取效率[25]。果膠酶能夠催化果膠質(zhì)分解，破壞黑木耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使糖醛酸能更好地溶出[26]?！颈狙芯壳腥朦c】目前的研究集中在黑木耳多糖提取工藝、分離純化和藥理活性的研究，關(guān)于純化的黑木耳多糖的單糖組成以及糖醛酸含量研究已有少量報道，但未見黑木耳糖醛酸的提取工藝的研究。因此，本研究針對黑木耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特性，結(jié)合物理、化學(xué)、生物酶等破壁方法，最大限度破壞黑木耳的細(xì)胞壁，促進(jìn)糖醛酸的溶出。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用超微粉碎技術(shù)降低黑木耳粉的粒徑，接著采用超聲波協(xié)同果膠酶技術(shù)提取黑木耳，最大限度破壞黑木耳的細(xì)胞壁，篩選適合糖醛酸提取的方法;其次以糖醛酸提取率為優(yōu)化指標(biāo)，篩選超聲波協(xié)同果膠酶法主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，最終獲得響應(yīng)面最佳工藝參數(shù)，為黑木耳糖醛酸純化制備、活性分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

黑木耳：市售優(yōu)質(zhì)黑龍江黑木耳，粉碎過18、28、50、70、100、150、200、250目篩;纖維素酶（酶活力50 000 U·g-1）、中性蛋白酶（酶活力10 000 U·g-1）、果膠酶（酶活力50 000 U·g-1），購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;95%乙醇、苯酚、濃硫酸、四硼酸鈉、D-葡萄糖醛酸、間羥基聯(lián)苯等化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BL60S電子天平，德國Sartrius;GL10MD高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀試驗儀器開發(fā)有限公司;R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司;CLARIO Star多功能酶標(biāo)儀，德國BMG LABTECH公司;KQ-600DV數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;SCIENTZ冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑木耳糖醛酸提取方法篩選

以傳統(tǒng)熱水提取為對照，比較超聲波、微波、光波等3種輔助提取方法，以及果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶等3種酶提取方式的黑木耳糖醛酸提取率，篩選適宜的提取方法。具體參數(shù)見表1。

1.2.2 黑木耳糖醛酸提取單因素試驗

經(jīng)上述試驗篩選，選取超聲波輔助果膠酶法進(jìn)行黑木耳糖醛酸提取。過250目篩（粒徑58 μm）黑木耳粉（除粒徑單因素實驗外）先用480 W超聲波處理20 min，然后用0.25%的果膠酶提?。ǔz酶單因素試驗外），酶解結(jié)束升溫至80℃水浴0.5 h滅酶。按表2的試驗設(shè)計進(jìn)行單因素試驗。每處理重復(fù)3次。

1.2.4 糖醛酸提取率的測定

（1） D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取0.5 mg·mL-1 D-葡萄糖醛酸儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0 mL于10 mL 容量瓶中，加水稀釋，得質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、40、50、60、70、100 μg·mL-1的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL 加入10 mL試管，置冰水浴中，再分別加入2.25 mL 四硼酸鈉-硫酸溶液繼續(xù)冷卻，在充分振蕩后，將試管置于100℃水浴加熱10 min，立即放入冰水浴至冷;之后加入0.025 mL 0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，充分振蕩，顯色，超聲去除氣泡，靜置20 min，以0.25 mL 蒸餾水同上制得空白液對照，于525 nm 處測定吸光度。以D-葡萄糖醛酸濃度對吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.0049x-0.0021， R2=0.9998，葡萄糖醛酸濃度在5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

（2）糖醛酸含量的測定 稱取5 g黑木耳粉，加水提取，7 500 r·min -1離心10 min，上清液備用，記錄體積并測定糖醛酸含量，糖醛酸含量的測定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，用等量樣液替代D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。按以下公式計算糖醛酸提取率：黑木耳糖醛酸提取率（‰）=[（C·V）/W]×1000。式中，C為供試液中糖醛酸質(zhì)量濃度（μg·mL-1）;V為提取液體積（mL）;W為供試黑木耳的質(zhì)量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的黑木耳糖醛酸提取率

不同提取方法對黑木耳糖醛酸提取率影響（表4）結(jié)果表明，以傳統(tǒng)熱水法的糖醛酸提取率為對照，超聲波、微波、光波3種輔助提取技術(shù)的糖醛酸提取率顯著提高，超聲波的糖醛酸提取率顯著高于微波和光波;中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶對提取糖醛酸有利，其糖醛酸提取率比單一熱水法顯著提高，果膠酶的糖醛酸提取效果顯著優(yōu)于纖維素酶和中性蛋白酶。綜合考慮提取效率、操作成本和后續(xù)的工業(yè)生產(chǎn)，采用超聲波協(xié)同果膠酶法提取黑木耳糖醛酸。

2.2 超聲波協(xié)同果膠酶提取黑木耳糖醛酸單因素試驗

2.2.1 不同粒徑對糖醛酸提取率的影響

從圖1可以看出，58 μm黑木耳粉的糖醛酸提取效果明顯優(yōu)于880 μm的黑木耳粉，糖醛酸提取率提高2倍，說明黑木耳粉越細(xì)越有利于黑木耳糖醛酸的溶出。粒徑在58～880 μm的范圍內(nèi)糖醛酸提取率變化巨大，隨粉末粒徑減小呈現(xiàn)平臺式不斷上升的趨勢，當(dāng)粒徑為270～880 μm時提取率基本穩(wěn)定，但是粒徑介于150～212 μm提取率迅速提高，當(dāng)粒徑為75～150 μm時提取率基本穩(wěn)定、但當(dāng)粒徑為58 μm時糖醛酸提取率迅速提高，達(dá)最大值4.30‰。受限于試驗室條件能做到最小粒徑58 μm，因此木耳粒徑采用250目超細(xì)粉進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.2 不同果膠酶添加量對糖醛酸提取率的影響

圖2的結(jié)果表明，不同果膠酶（酶活50 000 U·g-1）添加量對糖醛酸提取率影響不明顯，糖醛酸含量平均值為4.31‰，從提取成本、減少外源添加方面考慮，認(rèn)為添加0.25%果膠酶，即果膠酶100 U·g-1木耳進(jìn)行后續(xù)的提取試驗為宜。

2.2.3 不同液料比對糖醛酸提取率的影響

液料比對糖醛酸提取率的影響見圖3，糖醛酸提取率隨著液料比增加迅速提高，當(dāng)液料比為20? mL·g-1，黑木耳子實體提取液少而黏稠，熱水提取后成糊狀，提取液無法分離，不利于提取，當(dāng)液料比為40、50、60? mL·g-1，糖醛酸提取率基本穩(wěn)定，糖醛酸提取率平均值為4.89‰，當(dāng)液料比為80、100 mL·g-1，糖醛酸提取率迅速提高，達(dá)最大值7.65‰，提高了56%，當(dāng)液料比增加到110、120 mL·g-1，糖醛酸提取率下降。由于液料比越大，后續(xù)濃縮和干燥所需要的能耗越大，成本越高，所以選擇最佳液料比為100 mL·g-1。

2.2.4 不同提取溫度對糖醛酸提取率的影響

從圖4可以看出，糖醛酸提取率隨著溫度升高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，原因是果膠酶的活力受溫度影響，當(dāng)溫度為50℃，果膠酶的酶活最強(qiáng)，糖醛酸提取率最高達(dá)5.24‰。溫度高于55℃，或者低于50℃，果膠酶的酶活降低，糖醛酸提取率反而下降，所以選擇最佳提取溫度為50℃。

2.2.5 不同提取時間對糖醛酸提取率的影響

圖5可見，隨著提取時間的延長，糖醛酸提取率先升高后趨于平穩(wěn);當(dāng)提取時間為0.5～1.5 h時，糖醛酸提取率逐漸增加，提取時間達(dá)到2.0～3.0 h，糖醛酸提取率基本維持穩(wěn)定，當(dāng)提取時間2.0 h時，黑木耳糖醛酸提取率達(dá)到最大值，4.51 ‰，所以認(rèn)為最佳提取時間為2.0 h。

2.2.6 不同pH值對糖醛酸提取率的影響

從圖6中可以看出，在pH值為3.5～7.0，隨著酸堿度增加，糖醛酸提取率呈現(xiàn)先升后降的變化，當(dāng)pH5.5時，糖醛酸提取率最大達(dá)4.71‰。

2.2.7 不同超聲功率對糖醛酸提取率的影響

不同超聲功率對糖醛酸提取率的影響見圖7，隨著超聲功率增加，糖醛酸提取率平穩(wěn)上升，當(dāng)超聲功率600 W時，糖醛酸提取率最大達(dá)4.85‰。由于受實驗室超聲提取設(shè)備的超聲功率限制，當(dāng)超聲功率大于600 W對糖醛酸提取率的影響需要進(jìn)一步研究。

2.2.8 不同超聲時間對糖醛酸提取率的影響

不同超聲時間對糖醛酸提取率的影響見圖8，隨著超聲時間延長，糖醛酸提取率先上升后趨于穩(wěn)定，當(dāng)超聲時間30～60 min時，糖醛酸提取率基本穩(wěn)定，與超聲時間10、20 min相比，糖醛酸得率明顯提高;當(dāng)超聲時間60 min時，提取率最高5.00‰，但是超聲時間30 min與60 min的糖醛酸提取率差異不明顯，綜合考慮提取效率和成本，選擇最佳超聲時間30 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)表3的試驗因素水平，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計，試驗結(jié)果見表5。利用Design-Expert 11.0軟件對糖醛酸提取率結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合得到回歸模型為：Y=-237.95+1.73A-0.24B+0.30C+25.20D+0.06AD+0.14BD-0.01A2-0.01B2-3.43D2，二次多項式回歸模型方差分析結(jié)果見表6?；貧w方差方差分析結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)模型的P<0.001說明該模型極顯著。失擬項P=0.008，不顯著。決定系數(shù)R2=0.9672，說明模型擬合程度良好，回歸方程很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。矯正決定系數(shù)R2Adj=0.9345，說明僅有總變異不到7%不能由該模型解釋。變異系數(shù)CV=3.15%，說明試驗結(jié)果可靠。

A、B、AD、BD、A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值糖醛酸提取率的影響極顯著（P<0.01），D對響應(yīng)值糖醛酸提取率的影響顯著（P<0.05），而C、AB、AC、BC、CD對響應(yīng)值糖醛酸提取率的影響均不顯著（P>0.05）。在所取的各因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)F值和P值可以判斷各工藝條件對糖醛酸提取率的影響強(qiáng)弱，F(xiàn)值越大，說明作用影響越強(qiáng)（或P值越小，作用越強(qiáng)），影響因子的主效應(yīng)的主次順序為：液料比>提取溫度>pH值>超聲功率。

2.3.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪出的等高線圖（圖9）能比較直觀地解釋各變量之間對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，各個因素中液料比對糖醛酸提取率的影響最大，提取溫度的影響次之，pH值的影響第三，超聲功率的影響最小;交互作用中，提取溫度和pH值的交互作用對糖醛酸提取率的影響最大，液料比和pH值交互作用的影響次之，兩者之間交互作用明顯（P<0.01）。其他因素之間無明顯交互作用。從圖9-E可以看出，其等高線圖為橢圓形，說明提取溫度和pH值交互作用極明顯;響應(yīng)面坡度較為陡峭，響應(yīng)值隨pH值的變化率大于提取溫度的變化率，說明二者交互作用中pH值對糖醛酸提取率的影響大于提取溫度。從圖9-C可以看出，其等高線圖為橢圓形，說明料液比和pH值交互作用極明顯;響應(yīng)面坡度較為陡峭，響應(yīng)值隨pH值的變化率大于料液比的變化率，說明二者交互作用中料液比對糖醛酸提取率的影響大于pH值。

2.3.3 黑木耳糖醛酸的最佳工藝及驗證試驗

通過Design-Expert 11對二次多項式模型進(jìn)行求導(dǎo)，可得到該模型的極值點，預(yù)測糖醛酸的最大值為7.77‰，參數(shù)的最佳水平分別為：液料比109.26? mL·g-1、pH5.60、超聲功率535.69 W、提取溫度48.63℃，對最佳點調(diào)整為液料比110? mL·g-1、pH5.60、超聲功率540 W、提取溫度49℃，進(jìn)行5次重復(fù)試驗進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果驗證，取5次試驗結(jié)果的平均值，得到優(yōu)化后的糖醛酸提取率最大值為7.95‰，接近模型預(yù)測值7.77‰，該響應(yīng)面模型可以較好地預(yù)測黑木耳糖醛酸提取情況。

3 討 論

黑木耳糖醛酸是黑木耳多糖的成分之一，糖醛酸的提取與其子實體內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，黑木耳子實體橫切面中分為絨毛層、致密層、亞致密上層、中間層、下致密層和子實體層，細(xì)胞粗大、壁厚以及質(zhì)地堅韌致密使得黑木耳活性成分難以透過細(xì)胞壁溶于水中[27]。由于黑木耳糖醛酸含量較低，直接進(jìn)行黑木耳糖醛酸提取工藝的研究較少，一般先提取多糖;黑木耳多糖的單糖組成中含有葡萄糖醛酸，糖醛酸提取率與多糖提取率呈正相關(guān)。黑木耳多糖中糖醛酸含量的研究報道顯示：傳統(tǒng)熱水浸提法黑木耳的多糖提取率僅為4%～8%[28-29]，通過超微粉碎、超聲波、微波、生物酶法等提取技術(shù)破壁處理黑木耳的多糖提取率可達(dá)8%～25%[20-21，30]。許海林[31]優(yōu)化黑木耳水溶性多糖提取工藝，多糖得率8%，進(jìn)一步純化獲得多糖組分AAP-10、AAP-80，其糖醛酸的含量分別為23.76%和30.14%。樊黎生[32]純化黑木耳多糖AAP-Ⅱa組分中葡萄糖糖醛酸的含量為33.82%。本文研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熱水浸提法的糖醛酸含量2.64‰，采用超微粉碎法、超聲波聯(lián)合生物酶法的現(xiàn)代提取技術(shù)，在液料比110? mL·g-1、pH5.60、超聲功率540 W、提取溫度49℃的最佳工藝條件下，糖醛酸的提取率提高2倍，最高達(dá)7.95‰。本文首次研究黑木耳糖醛酸提取工藝，盡管糖醛酸和多糖的提取方法密切相關(guān)，提取因素水平存在差異，如有報道多糖提取最佳的液料比為80? mL·g-1[18]，綜合考慮多糖制備成本，甚至更低液料比，但是提取糖醛酸的最佳液料比是110? mL·g-1;另外，酶法的提取結(jié)果局限于所選用酶的種類和廠家，細(xì)胞壁由果膠、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等構(gòu)成，將果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等復(fù)合酶作用于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，理論上可以提升破壁效果，后續(xù)可進(jìn)一步研究其他商業(yè)單一酶和復(fù)合酶的提取效果，提高多糖中糖醛酸含量，為糖醛酸的進(jìn)一步純化制備、活性分析提供基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗篩選出液料比、pH、超聲功率和提取溫度 4 個因素，再通過響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)液料比為110? mL·g-1、pH值 5.60、超聲功率540 W、提取溫度49℃時，超聲波輔助提取黑木耳糖醛酸的得率達(dá)到7.95‰。研究以提高糖醛酸提取率為目標(biāo)，采用超聲波協(xié)同果膠酶法進(jìn)行提取，為黑木耳糖醛酸純化、活性分析的功能食品深加工提供有益的參考。

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（責(zé)任編輯：張 梅）