周光榮 尚昆 江龍

摘 要：為探明野生油茶根圍土壤AM真菌的種類(lèi)組成與多樣性。對(duì)野生油茶根圍土壤AM真菌進(jìn)行分離與形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)提取土壤DNA，進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定出3屬6種AM真菌，分別為臺(tái)灣硬囊霉、懸鉤子硬囊霉、黃孢球囊霉、長(zhǎng)孢球囊霉、蜜色無(wú)梗囊霉和柯氏無(wú)梗囊霉;通過(guò)高通量測(cè)序鑒定出球囊霉屬、原囊霉屬、近明囊霉屬等6屬42種AM真菌，其中有36個(gè)VT種;VTX00166和球囊霉屬分別為野生油茶根圍土壤AM真菌的優(yōu)勢(shì)種和優(yōu)勢(shì)屬;與形態(tài)學(xué)鑒定相比，高通量測(cè)序能檢測(cè)出更多的AM真菌種類(lèi)。

關(guān)鍵詞：油茶;AM真菌;高通量測(cè)序;多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

油茶（ Camellia oleifera） 為山茶科山茶屬的灌木或小喬木， 是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種[1]，主要分布在江西、湖南、廣西、廣東、貴州、云南、四川等省份[2]。從油茶籽中提取的油茶籽油富含不飽和脂肪酸，與橄欖油相似，被稱為“東方橄欖油” ，長(zhǎng)期食用，具有降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的作用[3-4]。AM真菌作為一類(lèi)分布極為廣泛的土壤微生物，能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中80%以上的高等植物形成菌根結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物群落的構(gòu)建，調(diào)控營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[5]。野生油茶能與叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza，AM）真菌共生形成菌根結(jié)構(gòu)，但野生油茶根圍土壤AM真菌的種類(lèi)組成與多樣性相關(guān)研究報(bào)道鮮見(jiàn)。目前，植物共生AM真菌多樣性研究主要通過(guò)AM真菌孢子的形態(tài)學(xué)鑒定，但由于受產(chǎn)孢時(shí)間及鑒定者辨識(shí)能力的影響，造成鑒定種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際共生種類(lèi)[6]。高通量測(cè)序具有分辨率高，測(cè)序耗時(shí)短，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)用于自然環(huán)境中AM真菌多樣性研究[7-9]。本文通過(guò)土壤AM真菌高通量測(cè)序技術(shù)與孢子形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合，摸清野生油茶根圍土壤AM真菌的種類(lèi)組成與多樣性特征，探究野生油茶在自然環(huán)境中的共生狀況。

1?材料與方法

1.1?樣品的采集及預(yù)處理

在貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)野生油茶林下設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)（樣點(diǎn)a、b、c），每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選取15株長(zhǎng)勢(shì)相似的野生油茶，采用抖落法[10]收集其根圍土壤，然后過(guò)2 mm土壤篩子，充分混勻。將樣品均分，1份裝入10 mL的無(wú)菌離心管中于冰盒保存，進(jìn)行高通量測(cè)序，1份用于AM真功形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2?形態(tài)學(xué)鑒定

稱取20 g土樣，采用濕篩傾析-蔗糖離心法[11]分離AM真菌孢子，將分離得到的孢子于體式顯微鏡下觀察，根據(jù)孢子的大小、形狀、顏色，連孢菌絲等進(jìn)行初步分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，挑取孢子于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子果及孢子的大小、形狀、顏色、表面紋飾，Melzer′s試劑反應(yīng)等特征并進(jìn)行拍照。根據(jù)AM真菌分類(lèi)專(zhuān)業(yè)網(wǎng)站（http：//www.amf￣phylogeny.com/）和相關(guān)INVAM網(wǎng)站（http：//invam.wvu.edu/home）、波蘭農(nóng)業(yè)大學(xué)（http：//www.zor.zut.edu.pl/）、Mycobank Database（http：//mycobank.org/）的種類(lèi)描述，參閱本實(shí)驗(yàn)室的AM真菌資源進(jìn)行種屬鑒定。

1.3?總DNA提取、18S rDNA序列擴(kuò)增及高通量測(cè)序

根據(jù)Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedical，USA）的使用說(shuō)明進(jìn)行總DNA的提取。DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。用兩對(duì)特異性引物AML1/AML2（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′;5′-GAACCCAAACACTTTGG-TTTCC-3′）和AMV4-5NF/AMDGR（5′-AAGCTCGTAGTTGAATT-TCG-3′;5′-CCCAACTAT-CCCTATTAATCAT-3′）進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增[12]。第一次擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，32個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min;擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶;0.2 μL BSA，10 ng DNA 模板，補(bǔ)ddH2O至20 μL。第二次PCR反應(yīng)以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，30 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min （PCR 儀：ABI GeneAmp 9700 型）;擴(kuò)增體系與第一次相同。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4?高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列經(jīng)Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的序列，F(xiàn)LASH 軟件進(jìn)行拼接，得到優(yōu)化后的序列。再使用Usearch軟件（vsesion 7.0 http：//drive5.com/usearch/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，并在聚類(lèi)的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。從每個(gè)OTU中選擇代表序列與MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.maarjam.botany.ut.ee/）進(jìn)行比對(duì)，將序列相似度≥97%、查詢序列的對(duì)齊長(zhǎng)度≥95%、e值<1e-50視為虛擬分子種（virtual taxa;VTs），與MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配的序列進(jìn)一步基于INSDC數(shù)據(jù)庫(kù)，在序列相似度90%和查詢序列的對(duì)齊長(zhǎng)度90%的基礎(chǔ)上選出疑似球囊菌亞門(mén)的序列[13]。

1.5?數(shù)據(jù)分析

使用I-Sanger生物信息分析云平臺(tái)（https：//www.i￣sanger.com/）繪制稀釋曲線。使用RStudio與R語(yǔ)言（3.6.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，vegan包計(jì)算α多樣性指數(shù)，pheatmap包繪制熱圖，statnet包和circlize包繪制弦狀圖。使用MEGA7軟件進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建Neighbor￣Joinning系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?測(cè)序質(zhì)量

通過(guò)高通量測(cè)序，從樣點(diǎn)a、樣點(diǎn)b、樣點(diǎn)c分別獲得24 790，24 828，20 866條有效序列;OTUs數(shù)分別為29，43，47個(gè)，共67個(gè)。由圖1可知，3個(gè)樣點(diǎn)的稀釋曲線均已趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序深度可以反映野生油茶根圍AM真菌的基本信息。

2.2?AM真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將67個(gè)OTUs的代表序列與MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)和INSDC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)58個(gè)OTUs屬于AM真菌。采用鄰接法（Neighbor￣joining）對(duì)58個(gè)OTUs的代表序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，58個(gè)OTUs分屬于6屬42種，其中包含36個(gè)VT種（圖2）。6個(gè)屬分別為球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無(wú)梗囊霉屬（Acaulospora）、類(lèi)球囊霉屬（Paraglomus）、多孢囊霉屬（Diversispora）;在6個(gè)屬中，球囊霉屬有26個(gè)VT種，原囊霉屬有2個(gè)VT種，近明囊霉屬有4個(gè)VT種，無(wú)梗囊霉屬有2個(gè)VT種，類(lèi)球囊霉屬和多孢囊霉屬分別有1個(gè)VT種。

2.3?AM真菌屬水平的相對(duì)豐度分析

從屬水平上來(lái)看（圖3），樣點(diǎn)a共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無(wú)梗囊霉屬（Acaulospora）、多孢囊霉屬（Diversispora）這5個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為99.44%、0.16%、0.02%、0.33%、0.05%。樣點(diǎn)b共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無(wú)梗囊霉屬

（Acaulospora）、類(lèi)球囊霉屬（Paraglomus）、多孢囊霉屬（Diversispora）這6個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為87.63%、1.99%、6.17%、2.49%、0.71%、1.01%。樣點(diǎn)c共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）和近明囊霉屬（Claroideoglomus）3個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為96.54%、1.17%和2.29%。其中球囊霉屬（Glomus）的總相對(duì)豐度為94.54%，遠(yuǎn)高于其他5個(gè)屬，為野生油茶根圍AM的優(yōu)勢(shì)屬。

2.4?AM真菌的種豐度分析

將所有種的相對(duì)豐度經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，繪制種水平的豐度熱圖（圖4）。圖中越偏紅表示其豐度越高，越偏藍(lán)表示其豐度越低。樣點(diǎn)a豐度較高的種有VTX00166、VTX00126、VTX00080、VTX00219;樣點(diǎn)b豐度較高的種有VTX00166、VTX00093、VTX00096、VTX00256;樣點(diǎn)c豐度較高的種有VTX00093、VTX00126、VTX00080、VTX00166。VTX00166在3個(gè)樣點(diǎn)都被檢測(cè)到，且豐度最高，為野生油茶根圍AM真菌的優(yōu)勢(shì)種。

2.5?野生油茶根圍AM真菌的α多樣性指數(shù)

利用R語(yǔ)言中vegan包對(duì)58個(gè)AM真菌的OTUs進(jìn)行分析，得到3個(gè)樣點(diǎn)的AM真菌多樣性指數(shù)（表1）。野生油茶根圍AM真菌的Shannon指數(shù)在2.78～3.09，Simpson指數(shù)在0.86～0.93，Chao1指數(shù)在27.33～44.00，Ace指數(shù)在28.93～44.00。

2.6?野生油茶根圍AM真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定出3屬6種AM真菌（圖5）。分別為硬囊霉屬2種：臺(tái)灣硬囊霉（Sclercystis Taiwanensis）和懸鉤子硬囊霉（Sclercystis rubiforme）;球囊霉屬2種：黃孢球囊霉（Glomus flavisporum）和長(zhǎng)孢球囊霉（Glomus dolichosporum）;無(wú)梗囊霉屬2種：蜜色無(wú)梗囊霉（Acaulospora mellea）和柯氏無(wú)梗囊霉（Acaulospora koskei）。

3?討論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)野生油茶根圍土壤AM真菌多樣性進(jìn)行調(diào)查，分析了野生油茶根圍土壤AM真菌在屬和種分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，共檢測(cè)出球囊霉屬、原囊霉屬、近明囊霉屬等6屬42種，其中球囊霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，優(yōu)勢(shì)種VTX00166亦屬于球囊霉屬，與WU等[14]在柑橘根圍土壤發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)屬結(jié)果一致。但覃曉娟等[15]在廣西紅壤區(qū)甘蔗根圍土壤中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)屬為根生囊霉屬，說(shuō)明了不同宿主植物根圍土壤的AM真菌存在不同的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定出6種AM真菌，分別為臺(tái)灣硬囊霉、懸鉤子硬囊霉、黃孢球囊霉、長(zhǎng)孢球囊霉、蜜色無(wú)梗囊霉、柯氏無(wú)梗囊霉。其中部分AM真菌在其他植物根圍也有發(fā)現(xiàn)，分布廣泛;如王幼珊等[16]在小葉青岡根圍發(fā)現(xiàn)了臺(tái)灣硬囊霉，羅協(xié)等[17]在鐵仔根圍發(fā)現(xiàn)了懸鉤子硬囊霉和黃孢球囊霉。依靠形態(tài)學(xué)鑒定往往丟失了不產(chǎn)孢的種類(lèi)，從而低估了AM真菌的物種多樣性[18];因此，與高通量測(cè)序相比，形態(tài)學(xué)鑒定可識(shí)別的AM真菌物種數(shù)相對(duì)較少;高通量測(cè)序更能反映野生油茶根圍AM真菌多樣性的真實(shí)情況。但目前通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)還無(wú)法分離AM真菌，只有通過(guò)孢子形態(tài)來(lái)分離鑒定AM真菌，所以保存AM真菌資源還離不開(kāi)孢子形態(tài)學(xué)鑒定方法。

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（責(zé)任編輯：周曉南）

Diversity Survey of AM Fungi in Rhizosphere

Soil of Wild Camellia oleifera

ZHOU Guangrong， SHANG Kun， JIANG Long*

（College of Life Sciences/ Key laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation

in Mountainous Region （Ministry of Education）， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：

In order to explore the species compositionand diversity of AM fungi in rhizosphere soil of wild Camellia oleifera， three wild Camellia oleifera rhizosphere soils were collected for the isolation and morphological identification of AM fungi， and the soil DNAs were extracted and sequenced by high￣throughput sequencing. The results show that six AM fungal species belonging to 3 genera were identified by morphology， including Sclercystis Taiwanensis， Sclercystis rubiforme， Glomusflavisporum， Glomus dolichosporum， Acaulospora mellea and Acaulospora koskei. High￣throughput sequencing identified 42 species of AM fungal from 6 genera including Glomus， Archaeospora， Claroideoglomus， Acaulospora， Paraglomus， Diversispora， among which 36 VT species. VTX00166 and Glomus were the dominant species and dominant genus of AM fungi in rhizosphere soil of wild Camellia oleifera.High￣throughput sequencing can detect more AM fungal species than morphological identification.

Key words：

Camellia oleifera; AM fungi; high￣throughput sequencing; diversity