練冬梅 賴正鋒 姚運法 洪建基

摘?要：根結線蟲種類繁多，鑒定黃秋葵根結線蟲病病原種類，可為黃秋葵根結線蟲病害防治提供信息基礎，并為今后開展黃秋葵根結線蟲病的抗病種質篩選、抗病育種提供重要理論依據(jù)。從被侵染的黃秋葵根組織中分離雌蟲，并采用形態(tài)學、同工酶和rDNAITSPCR相結合的方法鑒定黃秋葵根結線蟲病病原種類。結果表明：危害黃秋葵根結線蟲病的病原為南方根結線蟲Meloidogyne incognita。

關鍵詞：黃秋葵;根結線蟲病;病原鑒定

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.010

Abstract：There were many species of rootknot nematodes. Identifying the pathogenic species of rootknot nematode disease on okra can provide information basis for the prevention and control of rootknot nematode disease on okra， and provid important theoretical basis for the selection of diseaseresistant germplasms and diseaseresistant breeding of rootknot nematode disease in the future.The females were isolated from the infected root tissues of okra and the pathogenic species of okra rootknot nematode disease were identified by morphology， isozyme and rDNAITSPCR.The results showed that the rootknot nematodes which harmed okra were Meloidogyne incognita.

Key words：Okra; Rootknot nematode; Pathogen identification

黃秋葵Okra為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschu的一個種[1]，又名秋葵、補腎草、咖啡葵等。原產于非洲，自20世紀90年代初引入我國，現(xiàn)國內各地均有栽培。黃秋葵作為一種特色的保健型蔬菜，種植面積不斷擴大，福建漳州地區(qū)每年黃秋葵種植面積累計達到1300多hm2，在福建省建寧、泰寧和將樂等諸縣種植的黃秋奏品種洋辣、癡椒也已有百年之久[2]。由于黃秋葵生產規(guī)模化、設施化以及連作障礙嚴重，根結線蟲病已成為黃秋葵的最重要病害之一，極大地降低了黃秋葵的產量和質量[3]。黃秋葵植株根部受根結線蟲侵染后，側根和須根上產生根結，呈串珠狀或雞爪狀，表面粗糙，容易龜裂腐爛。由于根系畸變膨大，導致根部吸收營養(yǎng)成分和水分的運輸功能遭到破壞，從而引起植株矮化、褪綠、落葉甚至死亡[4]。

我國已報道的根結線蟲種類為57種，其中能引起蔬菜發(fā)生根結線蟲病的主要為南方根結線蟲Meloidogyne incognita[5]、象耳豆根結線蟲Meloidogyne enterolobii[6]、爪哇根結線蟲Meloidogyne javanica[7]、北方根結線蟲Meloidogyne hapla[8]、花生根結線蟲Meloidogyne arenaria[9]。常規(guī)的根結線蟲種類鑒定主要通過形態(tài)學鑒定、鑒別寄主及生化鑒定，近十幾年來，分子生物學技術的發(fā)展，為根結線蟲的準確鑒定提供了重要手段。根結線蟲種間存在顯著的致病差異，對黃秋葵根結線蟲種類的鑒定是防治根結線蟲病的重要前提。本研究在福建省漳州市黃秋葵種植區(qū)域監(jiān)測到黃秋葵根結線蟲的癥狀，通過病原分離鑒定，確定黃秋葵根結線蟲種類，為黃秋葵根結線蟲病的防治提供信息基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

在福建省漳州市采集黃秋葵根結線蟲發(fā)病植株根系，清洗干凈，挑取根系中淡黃色的單卵塊至1.5 mL離心管中，用1%NaClO溶液消毒5 min后，無菌水清洗3次，加入無菌水室溫下孵化24 h后接種于易感黃秋葵上進行培養(yǎng)，待后期鑒定。供試爪哇根結線蟲蟲源由海南省農業(yè)科學院植物保護研究所惠贈，并長期培養(yǎng)保存于易感番茄上。

1.2?病原線蟲的分離與鑒定

1.2.1?會陰花紋形態(tài)學鑒定?根結線蟲接種8周后，取被侵染的黃秋葵根組織進行雌蟲分離，分離出的單頭雌蟲，根結線蟲成熟雌蟲會陰花紋制作和觀察參照劉維志[10]和趙雷等[11]的方法。

1.2.2?同工酶分析?參照胡凱基[12]的方法，挑取20頭雌幼蟲置于1.5 mL的離心管中，加入15 μL酶浸提液，研碎，將酶提取物加入到7%分離膠、4%濃縮膠、膠厚1.0 mm的膠孔中，運用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行同工酶酯酶（EST）分析。電泳結束后參照胡凱基[12]的方法進行EST染色，以已鑒定的爪哇根結線蟲Meloidogyne javanica為對照。酯酶表型的判讀按照Esbenshade等[13]的方法。

1.2.3?rDNA的ITS區(qū)PCR鑒定?采用Vrain等[14]設計的引物18S（5′TTGATTACGTCCTGC CCCTTT3′）和28S（5′TTTCACTCGTTACTAAGG3′）進行rDNAITS擴增，引物由上海生工公司合成。將黃秋葵根結線蟲雌蟲置于200 μL的PCR管中，加入10 μL滅菌水，用10 μL槍頭將雌蟲刺破，內含物溢出，再加入8 μL10×PCR Buffer，并且以終度60 μg·mL-1的蛋白酶K處理，之后將樣品置于-70℃30 min，65℃下溫育1 h，95℃10 min，最終常溫下12000 r·min-1離心≥1 min，上清液可作PCR模板。PCR反應總體積為25 μL，包含12.5 μL Mix、正反引物各1 μL、線蟲DNA粗提液5 μL，加滅菌水補充至25 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)， 72℃充分延伸10 min，4℃保溫。取PCR產物5 μL在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀測拍照。剩余PCR產物通過回收、純化、克隆和測序后于NCBI上進行比對分析。

2?結果與分析

2.1?會陰花紋形態(tài)學觀察

根結線蟲雌蟲的會陰花紋背弓較高，花紋呈橢圓形，背弓由平滑到波浪形的線紋組成，一些線紋在側面分叉，無明顯側線，對照文獻資料[15]，初步確定黃秋葵根接線蟲為南方根結線蟲Meloidogyne incognita。

2.2?同工酶分析結果

對純化培養(yǎng)的黃秋葵根結線蟲雌幼蟲的酯酶進行電泳分析。經(jīng)同工酶的特異性染色后，黃秋葵根結線蟲酯酶譜型為I2型，為南方根結線蟲Meloidogyne incognita酯酶譜型。

2.3?rDNAITS分子鑒定結果

以黃秋葵根結線蟲粗提液為模板，用引物18S和28S擴增rDNA的ITS區(qū)序列。結果得到ITS片段均為750 bp左右。對rDNAITS區(qū)序列進行克隆與測序，產物大小為765 bp，將測序結果提交NCBI進行分析，與已知Meloidogyne incognita ITS區(qū)編碼序列相似性達到99%，由此確定黃秋葵根結線蟲病的病原為南方根結線蟲Meloidogyne incognita。

3?討論與結論

黃秋葵是兼食用和觀賞的作物，由于根結線蟲病是一種隱蔽性強的植物病害，不易被及時發(fā)現(xiàn)，所以根結線蟲侵染后往往導致黃秋葵產量大大降低，植株葉片發(fā)黃而失去觀賞價值。因此，應當進一步廣泛、深入地開展黃秋葵根結線蟲病的研究，為黃秋葵育種和根結線蟲病防治提供技術支持。目前國內天津地區(qū)為害黃秋葵的根結線蟲種類是南方根結線蟲Meloidogyne incognita[16]，國外也有報道[3]為害黃秋葵的根結線蟲種類是南方根結線蟲Meloidogyne incognita和象耳豆根結線蟲Meloidogyne enterolobii。由于寄主及環(huán)境條件的差異，根結線蟲形態(tài)上會存在著一定的變異。形態(tài)特征較多依賴雌蟲會陰花紋的觀察，表型判定標準對常見根結線蟲種群鑒定準確而有效，rDNAITSPCR技術是通過對區(qū)序列進行測序，并將測序獲得的序列與已知線蟲序列進行對比，從而獲得未知線蟲屬信息的方法，該方法在根結線蟲上已得到廣泛應用。因此本研究利用會陰花紋形態(tài)學、同工酶分析和分子生物學手段相結合的方法對黃秋葵病原線蟲進行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)黃秋葵根結線蟲病的病原為南方根結線蟲Meloidogyne incognita。

參考文獻：

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（責任編輯：柯文輝）