陳鳳婷 侯琳 韓清昕 于超 吳琍

[摘要]目的探討miR-429在人乳癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，初步鑒定miR-429的靶基因。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法檢測(cè)miR-429在人乳癌細(xì)胞系中的表達(dá)。通過MTT實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)確定miR-429對(duì)人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移的影響。采用生物信息學(xué)分析、qPCR和蛋白質(zhì)印跡方法鑒定miR-429的靶基因。結(jié)果miR-429在人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中低表達(dá)。上調(diào)miR-429表達(dá)后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力被顯著抑制（F=33.106，P<0.05），遷移能力明顯減弱（F=57.59，P<0.05）。過表達(dá)和抑制miR-429后，預(yù)測(cè)靶基因金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）mRNA表達(dá)水平均無明顯變化;然而，過表達(dá)miR-429后，TIMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（F=33.74，P<0.05）。結(jié)論在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)miR-429可抑制細(xì)胞增殖和遷移。miR-429的過表達(dá)可能通過轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制TIMP2蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)，初步鑒定TIMP2是miR-429的靶基因。

[關(guān)鍵詞]微RNAs;乳房腫瘤;細(xì)胞增殖;細(xì)胞運(yùn)動(dòng);金屬蛋白酶2組織抑制劑

[中圖分類號(hào)]R737.9[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2019）03-0325-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-429 （miR-429） in human breast cancer cell line and its effect on the proliferation and migration of human breast cancer cell， and to preliminarily identify the target genes of miR-429. MethodsQuantitative real-time PCR （qPCR） was used to measure the expression of miR-429 in human breast cancer cell line. MTT assay and wound healing assay were used to investigate the effect of miR-429 on the proliferation and migration of human breast cancer MDA-MB-231 cell line. bioinformatics analysis， qPCR， and Western blot were used to identify the target genes of miR-429. ResultsMiR-429 showed low expression in human breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines. After upregulation of miR-429 expression， MDA-MB-231 cells had significant reductions in proliferative capacity （F=33.106，P<0.05） and migration ability （F=57.59，P<0.05）. There were no significant changes in the mRNA expression of the predicted target genes TIMP2 and CREB1 after miR-429 overexpression or inhibition; however， there was a significant reduction in the relative expression of TIMP2 protein after miR-429 overexpression （F=33.74，P<0.05）. ConclusionOverexpression of miR-429 may inhibit the proliferation and migration of MDA-MB-231 cell line and reduce the expression of TIMP2 protein in MDA-MB-231 cell line through post-transcriptional translation， and therefore， TIMP2 is preliminarily identified as the target gene of miR-429.

[KEY WORDS]microRNAs; breast neoplasms; cell proliferation; cell movement; tissue inhibitor of metalloproteinase-2

在世界范圍內(nèi)，乳癌發(fā)病率位列女性惡性腫瘤之首，居癌癥死亡原因的第6位。目前乳癌的確診主要依靠空芯針穿刺和手術(shù)活檢，對(duì)病人創(chuàng)傷較大。影像學(xué)檢查和血液檢驗(yàn)主要用于檢查乳癌病人腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥，其靈敏度和特異度欠佳。因此，尋找在乳癌發(fā)生和進(jìn)展過程中起關(guān)鍵作用的特異腫瘤標(biāo)志物對(duì)于乳癌的診斷治療至關(guān)重要。微RNAs（miRNAs）是單鏈非編碼RNAs，20～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，屬于一類新的內(nèi)源性干擾RNAs[1]。其通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因沉默具有重要作用。miRNAs及其靶基因作為腫瘤標(biāo)志物在乳癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用是目前研究的熱點(diǎn)。miR-429作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。已有研究顯示，乳癌組織miR-429的表達(dá)較癌旁組織明顯減低。miR-429在不同人乳癌細(xì)胞系中的表達(dá)存在差異[3]。關(guān)于miR-429在人乳癌組織中的靶基因及其生物學(xué)功能研究較少，且存在一定的爭(zhēng)議。有研究結(jié)果證實(shí)，在人乳癌組織中，miR-429通過下調(diào)ZEB1、CRKL、LIMK1、PLCG1等靶基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為[4-6]，發(fā)揮抑癌作用。因此，探討miR-429在乳癌中的作用機(jī)制，關(guān)鍵是研究miR-429及其靶基因的作用。本研究旨在探討miR-429在人乳癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，以及miR-429過表達(dá)和抑制對(duì)人乳癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移的影響，并初步鑒定miR-429的靶基因，為明確miR-429參與乳癌的作用機(jī)制及尋找乳癌診斷、治療的標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人乳癌細(xì)胞系MCF-7（青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室）;人乳房上皮細(xì)胞系MCF-10A、人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室）;miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors、Cy3標(biāo)記的mimics NC（上海吉瑪公司）;RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;BI胎牛血清（青島博康生物科技有限公司）;DMEM/High Glucose培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）;MTT試劑（Sigma公司）;Trizol Reagent（Invitrogen公司）;TransIntroTM EL Trans-fection Reagent、熒光定量PCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、鼠抗人GAPDH抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;引物（上海桑尼生物科技有限公司）;兔抗人金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）抗體（恩晶生物）;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（北京博奧森公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、10 g/L青鏈霉素混合液的DMEM/High Glucose培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按每孔2×105接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)40%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)miRNA mimics和Trans-IntroTM EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染操作說明，用Cy3標(biāo)記的mimics NC和TransIntroTM EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后12 h更換含血清培養(yǎng)液并于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。最佳轉(zhuǎn)染條件為：mimics NC 12.5 μL、TransIntroTM EL Transfection Reagent 5 μL。細(xì)胞按轉(zhuǎn)染不同分為miR-429 mimics組（A組）、mimics NC組（B組）、control組（C組）、inhibitors NC組（D組）和miR-429 inhibitors組（E組）。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后接種于96孔板，每孔約6 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，共鋪4塊板。待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每天取一板細(xì)胞用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。從轉(zhuǎn)染12 h后開始檢測(cè)，每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。酶標(biāo)儀設(shè)置震板5 min溶解甲瓚顆粒，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度（A）值，以轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、A值為縱軸制作細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。分別于劃痕0、24 h時(shí)觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算劃痕面積，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。計(jì)算24 h劃痕愈合率[（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

1.2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并篩選miR-429靶基因以miR-429為檢索詞，分別在miRanda、Targetscan和Pictar數(shù)據(jù)庫中篩選miR-429可能的靶基因，將至少兩個(gè)軟件都能預(yù)測(cè)到的基因作為其可能的靶基因。為了深入了解miR-429對(duì)乳癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，將預(yù)測(cè)得到的miR-429靶基因進(jìn)行GO富集分析，選擇富集了參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的靶基因。通過miRNA CancerMap數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)分析排除已驗(yàn)證過的靶基因，最終選取TIMP2、CREB1、EDNRA、TUBB、DUSP1、MED13、LRP1、GDI2、GABPA、UBE2B、EPS8、MYCN、PLK2、OCLN等作為待測(cè)的miR-429靶基因。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)細(xì)胞miR-429表達(dá)水平和預(yù)測(cè)靶基因mRNA表達(dá)水平將轉(zhuǎn)染miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞以及只加TransIntroTM EL Transfection Reagent的control組細(xì)胞分別用Trizol法提取總RNA，測(cè)定各組RNA濃度，根據(jù)A260/280值判斷RNA純度。各組RAN A260/280均在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)，純度較高。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：65 ℃、5 min，冰上孵育2 min;42 ℃、15 min，85 ℃、5 s。根據(jù)qPCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s; 94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。各待測(cè)基因引物序列見表1。每組樣品至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。以2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞TIMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量將上述5組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入RIPA裂解，提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入6×Protein Loading Buffer后煮沸5 min。在120 g/L SDS-PAGE分離膠+50 g/L濃縮膠的凝膠系統(tǒng)中電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。條帶用50 g/L的脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2 h，用對(duì)應(yīng)的1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人TIMP2抗體、兔抗人CREB1抗體在搖床上室溫孵育2.5 h，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。用對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，重復(fù)TBST洗膜步驟，按說明配制ECL發(fā)光液并顯影。應(yīng)用Fusion FX7成像系統(tǒng)拍照并分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，樣本間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-429對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力影響

miR-429表達(dá)情況與培養(yǎng)時(shí)間存在交互效應(yīng)（F=5.941，P<0.05），miR-429表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖有顯著影響（F=33.106，P<0.05），從培養(yǎng)3 d開始各組的增殖水平開始出現(xiàn)差異（F=24.468、19.130，P<0.05）。培養(yǎng)3、4 d時(shí)miR-429 mimics組細(xì)胞增殖能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組明顯減低（t=5.193～7.338，P<0.05），而miR-429 mimics組和mimics NC組細(xì)胞增殖能力無顯著差異（t=1.243、3.121，P>0.05）。見圖1。

2.2miR-429對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力影響

miR-429 mimics組、mimics NC組、control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組細(xì)胞的劃痕愈合率分別為0.101±0.043、0.139±0.010、0.413±0.020、0.416±0.066和0.361±0.064，miR-429的表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力有顯著影響（F=57.59，P<0.05）。組間兩兩比較，miR-429 mimics組和mimics NC組細(xì)胞遷移能力差異無顯著意義（t=1.199，P>0.05），miR-429 mimics組細(xì)胞遷移能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhi-bitors組明顯減低（t=9.708～11.640，P<0.05）。

2.3miR-429在人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中的表達(dá)

與非致瘤的上皮細(xì)胞系MCF-10A相比，人乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-429的相對(duì)表達(dá)量分別為0.009±0.002（n=3）和0.007±0.002（n=4），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=921.264、1 233.490，P<0.05），結(jié)果表明miR-429在人乳癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系中低表達(dá)。

2.4過表達(dá)或抑制miR-429后預(yù)測(cè)靶基因mRNA水平的變化

通過生物信息學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)分析的方法得到預(yù)測(cè)靶基因TIMP2和CREB1。在MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中分別過表達(dá)和抑制miR-429，采用qPCR檢測(cè)各靶基因的mRNA表達(dá)水平變化。與control組相比，在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)和抑制miR-429，TIMP2和CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。見表2。

2.5miR-429對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中TIMP2蛋白表達(dá)的影響

miR-429 mimics組TIMP2蛋白表達(dá)明顯低于mimics NC組、control組、inhibitors NC組和miR-429 inhibitors組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.74，P<0.05）;而CREB1蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.557，P>0.05）。見表3。

3討論

目前，miR-429在乳癌中的生物學(xué)功能的研究較少。LI等[4]的研究結(jié)果表明，miR-429-5p通過LIMK1/CFL1通路顯著抑制人乳癌MDA-MB-231和HCC1937細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。秦科宇等[3]的研究表明，miR-429能夠顯著促進(jìn)人乳癌Bcap37細(xì)胞的增殖和遷移。本研究采用qPCR方法檢測(cè)顯示，miR-429在人乳癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞系中特異性表達(dá)下調(diào)。miR-429 mi-mics組較control組和inhibitors NC組細(xì)胞增殖、遷移能力減低，說明過表達(dá)miR-429可明顯抑制人乳癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移。這與LI等[4]的研究結(jié)果相一致。本文MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-429 mimics組和mimics NC組細(xì)胞增殖和遷移能力無顯著差異，可能是因?yàn)閙imics NC樣品不純。外源性補(bǔ)充miR-429 inhibitors對(duì)人乳癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移能力無明顯影響，可能是由于單鏈miR-429 inhibitors對(duì)內(nèi)源性miR-429抑制作用不顯著。miR-429在不同人乳癌細(xì)胞系中發(fā)揮不同作用，可能與該細(xì)胞系中miR-429及其靶基因表達(dá)譜相關(guān)，也可能與其所處的腫瘤微環(huán)境不同有關(guān)。

miR-429對(duì)TIMP2的靶向調(diào)控作用已經(jīng)在肺癌A549細(xì)胞系中得到證實(shí)[7]。該研究結(jié)果顯示，miR-429在A549細(xì)胞中高表達(dá)，外源性過表達(dá)miR-429可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本文研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-429的人乳癌MDA-MB-231細(xì)胞中，TIMP2蛋白表達(dá)水平明顯減低，而TIMP2 mRNA表達(dá)水平則無明顯變化，間接說明TIMP2是miR-429的靶基因，miR-429在蛋白質(zhì)翻譯過程中下調(diào)TIMP2的表達(dá)。

TIMP2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因子。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了TIMP2的表達(dá)失調(diào)[8-11]。有研究表明，TIMP2在乳癌[12-13]、卵巢癌[14]、肺癌[15]中呈高表達(dá)。TIMP2在體外降低生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖水平[16]，抑制新生血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[17]，不是通過抑制MMP的活性[16]。miR-429在腫瘤中的作用取決于TIMP2的多功能作用[18]。關(guān)于TIMP2在乳癌中抑癌作用的研究較少。本研究通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)證明，miR-429對(duì)TIMP2的抑制作用顯著。由本文MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)，miR-429抑制細(xì)胞增殖和遷移并不全是通過下調(diào)TIMP2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

已有研究對(duì)miR-429在癌癥中的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。WANG等[19]研究結(jié)果表明，miR-429通過靶向TRAF6抑制NF-κB途徑進(jìn)而抑制肝癌的進(jìn)展。TANG等[20]研究表明，miR-429通過靶向抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位，降低β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。CHEN等[21]研究結(jié)果表明，miR-429的過度表達(dá)通過抑制Wnt/β-catenin通路，抑制卵巢上皮癌細(xì)胞的侵襲和化學(xué)耐藥。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-429調(diào)控多個(gè)靶基因及信號(hào)通路。miR-429參與乳癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，乳癌中miR-429更多的靶基因及miR-429調(diào)控TIMP2發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1]BARTEL D P. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function （reprinted from cell， vol 116， pg 281-297， 2004）[J]. ?Cell， 2007，131（4，S）：11-29.

[2]CROCE C M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J]. ?Nature Reviews Genetics， 2009，10（10）：704-714.

[3]秦科宇，李恒宇，許鹿，等. 微RNA-429調(diào)控人乳腺癌Bcap37細(xì)胞系的增殖和遷移能力[J]. ?中華乳腺病雜志（電子版）， 2015，9（2）：89-95.

[4]LI Dengfeng， WANG Hong， SONG Hongming， et al. The microRNAs miR-200b-3p and miR-429-5p target the LIMK1/CFL1 pathway to inhibit growth and motility of breast cancer cells[J]. ?Oncotarget， 2017，8（49）：85276-85289.

[5]UHLMANN S， ZHANG J D， SCHWGER A， et al. miR-200bc/429 cluster targets PLCgamma1 and differentially regulates proliferation and EGF-driven invasion than miR-200a/141 in breast cancer[J]. ?Oncogene， 2010，29（30）：4297-4306.

[6]YE Zhibin， MA Gang， ZHAO Yahui， et al. miR-429 inhibits migration and invasion of breast cancer cells in vitro[J]. ?International Journal of Oncology， 2015，46（2）：531-538.

[7]LANG Yaoguo， XU Shidong， MA Jianqun， et al. MicroRNA-429 induces tumorigenesis of human non-small cell lung cancer cells and targets multiple tumor suppressor genes[J]. ?Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014，450（1）：154-159.

[8]BAJRACHARYA D， SHRESTHA B， KAMATH A A， et al. Immunohistochemical correlation of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitors of metalloproteinase-2 in tobacco asso-ciated epithelial dysplasia[J]. ?Disease Markers， 2014， 2014（3）：197813.

[9]ELLINA M I， BOURIS P， ALETRAS A J， et al. EGFR and HER2 exert distinct roles on colon cancer cell functional pro-perties and expression of matrix macromolecules[J]. ?Biochimica et Biophysica Acta， 2014，1840（8）：2651-2661.

[10]GURGEL D C， VALENCA-JUNIOR J T， DORNELAS C A， et al. Immunoexpression of metalloproteinases 2 and 14 and TIMP-2 inhibitor in main types of primary gastric carcinomas and lymph node metastasis[J]. ?Pathology & Oncology Research， 2015，21（1）：73-81.

[11]NAGASE H， VISSE R， MURPHY G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs[J]. ?Cardiovascular Research， 2006，69（3）：562-573.

[12]BEN NEJIMA D， BEN ZARKOUNA Y， GAMMOUDI A， et al. Prognostic impact of polymorphism of matrix metalloproteinase-2 and metalloproteinase tissue inhibitor-2 promoters in breast cancer in Tunisia： case-control study[J]. ?Tumor Biology， 2015，36（5）：3815-3822.

[13]ZHANG Ming， TENG Xiaodan， GUO Xinxin， et al. Expression of tissue levels of matrix metalloproteinases and their inhibitors in breast cancer[J]. ?Breast， 2013，22（3）：330-334.

[14]HAO A， NOWAK-MARKWITZ E， DONIZY P， et al. Enhanced immunoreactivity of TIMP-2 in the stromal compartment of tumor as a marker of favorable prognosis in ova-rian cancer patients[J]. ?The Journal of Histochemistry and Cytochemistry， 2012，60（7）：491-501.

[15]ZHU Lin， YU Hong， LIU Shiyuan， et al. Prognostic value of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in patients with non-small cell lung cancer： a systematic review and meta-analysis[J]. ?PLoS One， 2015，10（4）：e0124230.

[16]CHOWDHURY A， BRINSON R， WEI B A. Tissue inhibitor of metalloprotease-2（TIMP-2）：bioprocess development， phy-sicochemical， biochemical， and biological characterization of highly expressed recombinant protein[J]. ?Biochemistry， 2017，56（49）：6423-6433.

[17]STETLER-STEVENSON W G， SEO D W. TIMP-2： an endogenous inhibitor of angiogenesis[J]. ?Trends in Molecular Medicine， 2005，11（3）：97-103.

[18]BAKER A H， EDWARDS D R， MURPHY G. Metalloproteinase inhibitors： biological actions and therapeutic opportunities[J]. ?Journal of Cell Science， 2002，115（Pt 19）：3719-3727.

[19]WANG Peng， CAO Jia， LIU Shihai， et al. Upregulated microRNA-429 inhibits the migration of HCC cells by targeting TRAF6 through the NF-κB pathway[J]. ?Oncology Reports， 2017，37（5）：2883-2890.

[20]TANG Jing， LI Liang， HUANG Wentao， et al. MiR-429 increases the metastatic capability of HCC via regulating classic Wnt pathway rather than epithelial-mesenchymal transition[J]. ?Cancer Letters， 2015，364（1）：33-43.

[21]CHEN Hong， XIA Bairong， LIU Tianbo， et al. KIAA0101， a target gene of miR-429， enhances migration and chemoresistance of epithelial ovarian cancer cells[J]. ?Cancer Cell International， 2016，16：74.

（本文編輯 馬偉平）