范光森,劉朋肖,吳秋華,富志磊,成柳潔,朱宇婷,朱運(yùn)平,楊 然,李秀婷,*

(1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048; 2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048; 3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

白酒是我國(guó)國(guó)酒,它是借用酒曲這一特殊糖化發(fā)酵劑催化富含淀粉質(zhì)的糧谷發(fā)酵,再經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成的酒精飲料[1]。在白酒中,乙醇是其主體成分,酒醅中乙醇含量很大程度上決定了白酒的產(chǎn)量,另外,乙醇體積分?jǐn)?shù)還是評(píng)價(jià)白酒品質(zhì)的重要質(zhì)量指標(biāo),與白酒的香氣、口味和風(fēng)格息息相關(guān)[2-3]。眾所周知,微生物,尤其是釀酒酵母的代謝活動(dòng)是白酒釀造中乙醇的重要來源,對(duì)于白酒發(fā)酵速率、產(chǎn)量、風(fēng)味和品質(zhì)具有重要的作用[4-5]。因此,有必要系統(tǒng)探究微生物中的釀酒酵母產(chǎn)乙醇的發(fā)酵條件。

中國(guó)白酒傳統(tǒng)的釀造工藝生產(chǎn)過程更多的局限于手工操作,勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低,在勞動(dòng)力成本大幅度提升的今天,有必要在進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上推進(jìn)機(jī)械化程度的提高,實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)釀造方式向現(xiàn)代化釀造方式轉(zhuǎn)型[6]。在這一過程中,看似機(jī)械化設(shè)備的研制與使用是實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵,但事實(shí)上,蘊(yùn)含在白酒釀造過程中的內(nèi)在機(jī)制解析才是真正實(shí)現(xiàn)白酒釀造現(xiàn)代化生產(chǎn)的核心,也是更好實(shí)現(xiàn)機(jī)械化設(shè)備應(yīng)用的前提[7]。在這一趨勢(shì)的推動(dòng)下,中國(guó)白酒的釀造已涌現(xiàn)部分現(xiàn)代化釀造方式嘗試的案例,如不銹鋼槽車地面恒溫發(fā)酵系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)地缸發(fā)酵,發(fā)酵桶、發(fā)酵池代替?zhèn)鹘y(tǒng)發(fā)酵設(shè)備陶缸或窖池[8]。在機(jī)械化程度提升的過程中,釀造方式也發(fā)生了微妙的變化,嚴(yán)格地講,是微生物釀造微環(huán)境發(fā)生了改變。在采用地上釀造方式代替地下釀造方式轉(zhuǎn)變中,較為突出的微環(huán)境變化便是釀酒過程中氧氣的含量。那么,隨之帶來的是釀造所用微生物特性也必須隨之改變,由較為嚴(yán)格的厭氧環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒀趸蛴醒醐h(huán)境。為適應(yīng)白酒釀造環(huán)境的變化,選育獲得在有氧條件下高產(chǎn)乙醇的酵母,并對(duì)其產(chǎn)乙醇發(fā)酵條件進(jìn)行研究成為首要的工作。這一工作的開展將會(huì)改善我國(guó)白酒生產(chǎn)工藝,適應(yīng)現(xiàn)代化釀造方式,促進(jìn)中國(guó)白酒的現(xiàn)代化釀造發(fā)展[9]。前期,本研究團(tuán)隊(duì)從白酒釀造用大曲中篩選獲得一株在有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母YF1914,但尚未對(duì)其產(chǎn)乙醇發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)研究[10]。因此,本文將通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其在有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇的發(fā)酵條件,并對(duì)其產(chǎn)香特性進(jìn)行了研究,為未來白酒生產(chǎn)方式變革提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母YF1914 本實(shí)驗(yàn)室自行篩選和保存;乙醇、二辛醇 購(gòu)自Sigma公司;葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂等試劑 均為國(guó)產(chǎn)生物或分析純?cè)噭?YPD培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10、瓊脂粉20,115 ℃滅菌20 min;乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖200、酵母浸粉10、蛋白胨20、硫酸銨1、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂1,蒸餾水定容,pH自然，115 ℃滅菌20 min(培養(yǎng)基中酵母浸粉和胰蛋白胨各自濃度分別與各自產(chǎn)品標(biāo)識(shí)中的有效氮量的乘積之和為該培養(yǎng)基的有效氮濃度);高粱 購(gòu)自山東臨沂沂南地區(qū)。

YQX-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;電子天平、pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;LHS-100CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器設(shè)備有限公司;TU-19紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Microfuge 2R離心機(jī) 北京田林恒泰科技有限公司;1260series高效液相色譜儀 Agilent 科技有限公司;TSQTM8000 evo三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化 將實(shí)驗(yàn)室保存于甘油管中的釀酒酵母YF1914接種于YPD液體培養(yǎng)基中(50 mL裝于250 mL三角瓶),30 ℃、120 r/min培養(yǎng)活化24 h,然后接入乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用step-by-step單因素優(yōu)化方法,按照表1中所列因素依次進(jìn)行考察優(yōu)化其產(chǎn)乙醇發(fā)酵條件。

表1 優(yōu)化酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件參數(shù)Table 1 Experimental parameters for optimal ethyl alcohol production

1.2.2 酵母發(fā)酵產(chǎn)香 將酵母YF1914在YPD液體培養(yǎng)基(固體YPD培養(yǎng)基中不添加瓊脂)中活化,以1%的接種量接種于高粱浸出液培養(yǎng)基中,在30 ℃下,120 r/min培養(yǎng)32 h。發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min離心10 min,取上清液采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(SPME-GC-MS)檢測(cè)該酵母所產(chǎn)揮發(fā)性香氣成分。高粱浸出液培養(yǎng)基的制備參照之前文獻(xiàn)[11]進(jìn)行,具體操作如下:稱取250 g高粱粉碎至100目以下后,與水1∶4混合,待煮沸后,保持90 ℃條件下加入耐高溫α-淀粉酶液化1 h,冷卻,加入糖化酶于60 ℃下糖化2 h。糖化后,室溫條件下,轉(zhuǎn)速為10000 r/min,離心10 min,取上清,采用4層紗布進(jìn)行過濾,得到濾液,將浸出液的糖度調(diào)至10 °Brix,分裝于三角瓶中,115 ℃滅菌20 min。

1.2.3 酵母生物量和發(fā)酵液pH測(cè)定 酵母生物量采用分光光度計(jì)于560 nm處測(cè)定吸光值計(jì)算,發(fā)酵液pH利用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.4 高效液相色譜法測(cè)定乙醇和葡萄糖含量 發(fā)酵液于室溫條件下,10000 r/min 離心10 min,獲得上清液,上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾,參照Sun[12]文獻(xiàn)進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)乙醇和葡萄糖。具體方法的參數(shù)為:BioRad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm);0.01 mol/L H2SO4,流速0.5 mL/min;柱溫25 ℃,進(jìn)樣量20 μL,外標(biāo)法定量。

1.2.5 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定揮發(fā)性成分 參照范光森等[13]的方法,具體如下:發(fā)酵液裝入頂空瓶中于50 ℃平衡30 min,將預(yù)處理好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min,然后移入氣相色譜的高溫氣化室解吸5 min,進(jìn)行氣質(zhì)分析;毛細(xì)管色譜柱為DB-FFAP(60 m×250 μm×0.25 μm),自動(dòng)進(jìn)樣,分流比為10∶1,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,檢測(cè)器溫度250 ℃,載氣為氦氣,流速為1 mL/min,程序升溫50 ℃,保留2 min,以8 ℃/min的速率升至120 ℃,保留2 min,再以10 ℃/min升至200 ℃,穩(wěn)定5 min,最后以5 ℃/min升至250 ℃,穩(wěn)定20 min;EI電離源,電子能量70 eV,掃描范圍10～500 u,離子源溫度250 ℃,接口溫度250 ℃;通過質(zhì)譜解析與NIST 11譜庫(kù)和文獻(xiàn)保留指數(shù)比對(duì)確定各化合物結(jié)構(gòu),并采用二辛醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)半定量法計(jì)算各化合物的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)平行,采用SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析,利用Excel 2016和Origin 9.0繪圖軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

由圖1可以看出,隨著葡萄糖初始濃度的增加,乙醇濃度先增加后降低,當(dāng)葡萄糖初始濃度為350 g/L時(shí),乙醇濃度最大,為102.5 g/L。葡萄糖是酵母生長(zhǎng)繁殖及轉(zhuǎn)化為乙醇的動(dòng)力能源,在其濃度較低時(shí),酵母生長(zhǎng)繁殖受到底物濃度不足的影響,乙醇產(chǎn)量不高,因此會(huì)隨著葡萄糖初始濃度的增加,乙醇產(chǎn)量不斷增加;而當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)(大于350 g/L),雖然前期研究結(jié)果表明該菌株能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的葡萄糖,但高濃度的葡萄糖形成的高滲透壓會(huì)對(duì)酵母正常生長(zhǎng)和繁殖造成較大的影響,從而造成乙醇產(chǎn)量下降[10]。曹宇龍等[14]研究表明葡萄糖初始濃度為286.5 g/L時(shí)乙醇發(fā)酵結(jié)果較為理想;伍保龍等[15]研究結(jié)果顯示葡萄糖濃度為320 g/L時(shí)乙醇產(chǎn)量最高,這與本文研究結(jié)果較近。不同的酵母具有不同的葡萄糖耐受性,因此發(fā)酵產(chǎn)乙醇所需的最佳葡萄糖初始濃度也會(huì)有所差異。針對(duì)本文研究的酵母YF1914,其最佳產(chǎn)乙醇的葡萄糖初始濃度為350 g/L。

圖1 葡萄糖濃度對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.1 Effect of glucose concentration on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914注:含有相同的字母表示采用Tukey test檢驗(yàn)時(shí) 組間沒有顯著差異(p>0.05), 不同字母表示有顯著差異(p<0.05)；圖2～圖9同。

2.2 氮源種類對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

氮源是酵母生長(zhǎng)繁殖所需的重要營(yíng)養(yǎng)源,不同的氮源種類對(duì)酵母生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成及其它生理機(jī)能的影響不同[16]。由圖2可以看出,在促進(jìn)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇方面,有機(jī)氮源明顯優(yōu)于無機(jī)氮源,并且在相同有效氮濃度下(41.6 g/L),以酵母浸粉為唯一氮源時(shí),乙醇產(chǎn)量最高,達(dá)到111.7 g/L,與初始培養(yǎng)基復(fù)合氮源(酵母浸粉和蛋白胨)條件下的乙醇產(chǎn)量沒有顯著性差異。這可能是酵母浸粉中含有酵母生長(zhǎng)所需要的微量元素及生長(zhǎng)因子,能有效縮短酵母的遲滯期,快速大量合成胞內(nèi)RNA,快速轉(zhuǎn)錄和表達(dá)與氮源代謝、乙醇發(fā)酵相關(guān)的基因[17]?？紤]到成本問題,后續(xù)試驗(yàn)都以添加單一氮源酵母浸粉進(jìn)行。

圖2 氮源種類對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.3 氮源濃度對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

由圖3可以看出,酵母浸粉濃度對(duì)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇具有一定的影響,隨著濃度的增加,乙醇產(chǎn)量先增加后降低,之后有輕微的波動(dòng)。當(dāng)酵母浸粉濃度為原乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基有效氮濃度下(41.6 g/L,原乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基有效氮濃度與酵母浸粉產(chǎn)品標(biāo)識(shí)有效氮量的比值)，乙醇產(chǎn)量最高為113.5 g/L。在氮源缺乏的情況下,細(xì)胞中的蛋白質(zhì)及ATP含量較低,對(duì)酵母發(fā)酵乙醇的能力產(chǎn)生影響;氮源濃度過高,則會(huì)造成菌體生長(zhǎng)過于旺盛,造成局部或階段性供氧不足,引起提前衰亡[18-19]。因此,選擇41.6 g/L為后續(xù)酵母浸粉的添加量。

圖3 酵母浸粉濃度對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.3 Effect of concentration of yeast extract on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.4 pH對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

pH不僅對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,而且也會(huì)對(duì)其代謝通路進(jìn)行調(diào)控[20]。通過優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH發(fā)現(xiàn),隨著初始pH的升高,酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力不斷增加,當(dāng)初始pH為5～7時(shí),酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇最高,這與酵母本身生長(zhǎng)最適pH范圍一致,這表明pH主要是通過影響酵母的生長(zhǎng)速率調(diào)控乙醇產(chǎn)量(圖4)。為后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和一致性,后續(xù)發(fā)酵所用培養(yǎng)基的pH統(tǒng)一調(diào)整為自然pH,即pH為5.8進(jìn)行。

圖4 pH對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.4 Effect of pH on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.5 溫度對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

溫度主要是通過影響酵母體內(nèi)生物酶的活性來調(diào)控生長(zhǎng)和代謝活性。由圖5可以看出在30～36 ℃之間培養(yǎng)時(shí),酵母YF1914發(fā)酵產(chǎn)乙醇較高,這與該酵母具有較寬廣的最適溫度有關(guān),酵母YF1914這一特點(diǎn)正適應(yīng)了白酒釀造過程中溫度變化范圍大的特征,其這一特點(diǎn)可能正是長(zhǎng)期處于白酒釀造發(fā)酵體系中選育的結(jié)果?？紤]到釀酒酵母一般生長(zhǎng)溫度及其發(fā)酵產(chǎn)乙醇溫度,后續(xù)試驗(yàn)選擇30 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖5 溫度對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.5 Effect of temperature on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.6 種齡對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

不同種齡的酵母對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)能力不同,因此會(huì)影響到酵母發(fā)酵產(chǎn)物生成的速率和產(chǎn)量。由圖6可以看出,接入不同種齡的釀酒酵母所產(chǎn)乙醇有所差異,處于延緩期以及對(duì)數(shù)前期的種子液(0～12 h)，由于細(xì)胞處于適應(yīng)環(huán)境狀態(tài)以及實(shí)際接入的細(xì)胞數(shù)較少,因此將此時(shí)的種子進(jìn)行接種,乙醇產(chǎn)量較低;處于對(duì)數(shù)期中后期的種子液(15～24 h)，細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境,并且細(xì)胞數(shù)量相比其它時(shí)期較多,因此此時(shí)的種子發(fā)酵所產(chǎn)乙醇量較高;當(dāng)種子液處于平穩(wěn)期時(shí)(27～36 h),雖然實(shí)際接入細(xì)胞數(shù)量與對(duì)數(shù)中后期時(shí)基本一致,但其細(xì)胞活力相比對(duì)數(shù)期有所下降,因此不利于其發(fā)酵產(chǎn)乙醇?？傊?處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的酵母其發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力較好,這與絕大多數(shù)微生物接種時(shí)對(duì)菌種菌齡的要求一致[21-22]。為此,本研究選擇培養(yǎng)18 h的酵母作為種子液進(jìn)行接種。

圖6 種齡對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.6 Effect of inoculum age on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.7 接種量對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

接種量會(huì)直接影響酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇速率,一般來講,接種量少,延緩期長(zhǎng),酵母產(chǎn)乙醇速率低,接種量高,可能會(huì)由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或氧氣不足導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量低。通過研究接種量對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響發(fā)現(xiàn),隨著接種量的增加,該酵母發(fā)酵乙醇濃度不斷增加,即使在較高接種量條件下,其發(fā)酵產(chǎn)乙醇未受到影響(圖7)。高接種量這一特性為防止污染其它雜菌提供了保障[23]。考慮到接種成本,后續(xù)研究中,以1%的接種量進(jìn)行。

圖7 接種量對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.8 轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)酵母YF1914產(chǎn)乙醇的影響

由圖8可以看出,隨著轉(zhuǎn)速的提高,酵母YF1914發(fā)酵產(chǎn)乙醇濃度不斷增加,當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到90～150 r/min時(shí),乙醇濃度差異不大,為酵母YF1914產(chǎn)乙醇較優(yōu)的條件,其中在120 r/min時(shí),產(chǎn)量達(dá)到118.4 g/L,稍高于其它條件,因此選擇120 r/min作為后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件。圖9表明,該酵母裝液量在100 mL/250 mL以下時(shí),發(fā)酵產(chǎn)乙醇效果較好,即使裝液量低至25 mL/250 mL時(shí),其乙醇產(chǎn)量仍處于較高水平,其中在裝液量為50 mL/250 mL時(shí),乙醇濃度達(dá)到117.6 g/L,因此后續(xù)以此裝液量進(jìn)行其它條件的考察。酵母YF1914這一特點(diǎn)正好符合本文研究的出發(fā)點(diǎn),即在有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇,這為將來白酒釀造方式的變革提供有利依據(jù)。溶氧水平對(duì)于酵母發(fā)酵生成乙醇而言有利有弊:一方面微量的溶氧是酵母保持細(xì)胞活性,提高乙醇耐受性必需的;另一方面又會(huì)抑制糖酵解途徑,減少乙醇合成前體物質(zhì),降低乙醇得率[24]。

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.8 Effect of agitation speed on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

圖9 裝液量對(duì)酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.9 Effect of liquid medium volume on ethyl alcohol production from yeast strain YF1914

2.9 酵母YF1914產(chǎn)乙醇?xì)v程

圖10表明,在靜置發(fā)酵方式下,酵母YF1914發(fā)酵112 h乙醇濃度達(dá)到108.3 g/L,而搖動(dòng)條件下僅需32 h乙醇濃度達(dá)到124.7 g/L。比較兩種發(fā)酵方式的酵母量,很明顯可以看出,在搖動(dòng)培養(yǎng)方式下酵母量明顯高于靜置培養(yǎng)條件下的酵母量。合適的氧氣含量能使菌體維持較長(zhǎng)的活力,并有可能耐受更高濃度的初始糖濃度,減少發(fā)酵周期,提高乙醇得率[24]。與相對(duì)缺氧(靜置方式)條件下相比,在有氧條件(搖動(dòng)方式)下酵母YF1914能夠快速生長(zhǎng)繁殖,通過細(xì)胞量的提高來實(shí)現(xiàn)有氧條件下快速高效地轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙醇的目的。考慮到該菌株后期可以在有氧環(huán)境下高產(chǎn)乙醇,因此對(duì)該環(huán)境下培養(yǎng)過程的理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明(圖11),在有氧環(huán)境下培養(yǎng)時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄糖濃度快速下降,發(fā)酵32 h后,發(fā)酵培養(yǎng)基中就已經(jīng)幾乎沒有葡萄糖存在,這與該菌株在有氧條件下細(xì)胞量快速生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。另外,在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基pH隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先快速降低后升高,這可能是由于在發(fā)酵前期葡萄糖含量充足,酵母快速生長(zhǎng)并發(fā)酵產(chǎn)生大量酸類物質(zhì),引起pH快速下降,后期葡萄糖消耗完全,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足,酵母開始衰亡,細(xì)胞破裂引起pH稍微升高,這與酵母量及葡萄糖變化規(guī)律一致?？梢?在搖動(dòng)條件下,即有氧條件下,該酵母在葡萄糖消耗完全時(shí)(32 h),乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高,為124.7 g/L。

圖10 酵母YF1914發(fā)酵合成乙醇?xì)v程Fig.10 Time course of ethyl alcohol production by yeast strain YF1914

圖11 酵母YF1914發(fā)酵過程中 葡萄糖濃度和pH變化情況Fig.11 Glucose concentration and pH changes during the fermentation process of yeast strain YF1914

2.10 酵母YF1914液體發(fā)酵產(chǎn)香特性

采用SPME-GC-MS法對(duì)酵母YF1914發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表2。由表2可以看出,酵母YF1914能夠產(chǎn)生35種風(fēng)味物質(zhì),其中包括醇類13種、酯類11種、醛類2種、酮類1種、烷烴類3種、烯類1種、酚類2種、呋喃類1種和酸類1種,該酵母所產(chǎn)這些風(fēng)味物質(zhì)對(duì)于其在白酒釀造過程中的應(yīng)用及提高和豐富白酒風(fēng)味具有一定的意義。酵母YF1914所產(chǎn)異丁醇和異戊醇都是高級(jí)醇,雖然含量過多對(duì)酒的感官存在一定的副作用,但在合理的濃度范圍內(nèi)卻是白酒中醇甜和助香劑的主要物質(zhì),也是形成香味物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)[25]。雖尚無明確的研究表明高級(jí)醇含量發(fā)揮醇甜和助香作用的濃度,但依據(jù)白酒相關(guān)的現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量要求(<30 mg/L)可以初步推斷其發(fā)揮以上作用的濃度應(yīng)<30 mg/L[26]。2,3-丁二醇是酵母發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生的,具有增加酒的甜味作用,是當(dāng)前白酒甜感的重要風(fēng)味來源[27]。酵母YF1914所產(chǎn)的芳樟醇是一種萜烯類化合物,不僅具有一定的藥理作用,而且還賦予白酒濃青帶甜的木青香,該風(fēng)味物質(zhì)多在玫瑰香型葡萄酒中發(fā)現(xiàn),在白酒中鮮有報(bào)道[28]。3-甲硫基丙醇存在于多種酒飲料中,具有洋蔥、甜的肉及肉湯的氣味,并且被定為芝麻香型白酒的特征風(fēng)味物質(zhì),對(duì)白酒品質(zhì)具有重要的影響,該酵母能夠發(fā)酵產(chǎn)3-甲硫基丙醇,對(duì)提高白酒焙烤香具有重要的作用[29]。(R)-(+)-β-香茅醇和香葉醇是單萜醇類物質(zhì),是啤酒酒花香氣的重要成分,對(duì)啤酒香氣質(zhì)量產(chǎn)生直接影響,在白酒中也較少有報(bào)道,而該酵母發(fā)酵能夠產(chǎn)生這兩種風(fēng)味物質(zhì),不僅提高白酒香氣,在白酒釀造中有較好的應(yīng)用前景,在啤酒釀造中也具有應(yīng)用潛力[30]。酵母YF1914具有突出的β-苯乙醇生產(chǎn)能力,而β-苯乙醇能夠賦予白酒淡雅玫瑰香味[31]。該酵母還能產(chǎn)生具有保健功效的成分反式-橙花叔醇、紅沒藥醇、對(duì)羥基苯乙醇、金合歡烯等[32-35]。具有清新的果香與酒香的乙酸乙酯是清香型、老白干香型和米香型等香型白酒的特征風(fēng)味物質(zhì),而乙酸苯乙酯則具有舒適的花香,2-甲基丁酸-2-苯乙酯具有一定的茶香味,這些酯類化合物能夠提高白酒的香味,由表2可見該酵母具有一定的產(chǎn)酯增香能力[36-38]。另外,該酵母還能夠產(chǎn)生具有油脂香的3-羥基-2-丁酮[33]。綜上可見,該酵母不僅具有在有氧條件下高產(chǎn)乙醇特點(diǎn),還具有突出的產(chǎn)香特性。

表2 酵母YF1914發(fā)酵液中揮發(fā)性成分組成及含量(g/L)Table 2 Composition and content of volatile components of yeast strains YF1914 in the fermentation broth(g/L)

3 結(jié)論

本研究對(duì)一株釀酒酵母YF1914在有氧環(huán)境下產(chǎn)乙醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,為未來因白酒釀造方式改變帶來的微環(huán)境變化提供適合的釀造菌株及發(fā)酵參數(shù)。本文在原有基礎(chǔ)的乙醇發(fā)酵條件下(硫酸銨1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂1 g/L),通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,最終確定該酵母產(chǎn)乙醇的最佳條件為:葡萄糖350 g/L,酵母浸粉41.6 g/L,初始pH5.8,接種量1%,裝液量50 mL/250 mL,在30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)32 h。在該條件下酵母YF1914合成乙醇高達(dá)124.7 g/L,并且該酵母液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生較多的呈香風(fēng)味物質(zhì),這一結(jié)果為未來白酒實(shí)現(xiàn)有氧發(fā)酵的釀造方式提供數(shù)據(jù)參考。