范春霞,王軍節(jié),*,彭期定,王 鵬

(1.北方民族大學植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室,寧夏銀川 750021; 2.北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏銀川 750021)

玉金香甜瓜(CucumismeloL.cv.Yujinxiang)是我國西北地區(qū)主要栽培的經(jīng)濟作物,因其果實口感脆甜而深受廣大消費者喜愛[1]。甜瓜果實采收期較為集中且正值夏季高溫,并且貯運過程冷鏈缺乏或不完整,釆后流通各環(huán)節(jié)極易因遭受病菌侵染而腐爛變質,給當?shù)剞r(nóng)戶和經(jīng)銷商帶來巨大經(jīng)濟損失[2]。研究表明黑霉、青霉、白霉和粉霉是造成該果采后主要的真菌病害,且由粉霉造成的粉霉病最為嚴重[3]。因此,研究玉金香甜瓜粉霉病的控制措施十分必要。

病原鑒定是病害防治的前提與基礎,形態(tài)學和分子生物學鑒定是目前病原真菌鑒定的主要手段。殷輝等[4]采用形態(tài)學特征及ITS序列特征分析,確定引起棗貯藏期粉霉病的致病菌為粉紅單端孢。王勇等[5]對番茄粉霉病的致病菌進行了鑒定,確定為粉紅單端孢。

化學殺菌劑如嘧菌酯雖能有效控制果蔬采后病害,但因存在藥物殘留、環(huán)境污染及病原物抗藥性等問題而應用受限[4,6]。因此,開發(fā)綠色安全環(huán)保的措施已成為病害控制主要方向。植物精油和天然公認的安全藥物成為研究熱點,月桂酸是椰子、油棕等精油的主要成分之一,其對番茄葉霉病具有控制效果[7],富饒等[7]研究發(fā)現(xiàn):月桂酸對番茄葉霉菌菌絲均具有抑制作用,濃度為1 mmol/L時抑菌效果最好;香芹酚為牛至、石香蕾、百里香等植物精油的主要成分之一,對桔子青霉[8]、面包酵母和黑曲霉[9]具有抑制效果,王新偉等[9]發(fā)現(xiàn):香芹酚濃度為0.125 μL/mL時可抑制面包酵母的生長,濃度為0.0625 μL/mL時可抑制黑曲霉的生長;硅酸鉀具有控制指狀青霉、意大利青霉[10]和腐霉菌[11]等病原引起果實采后病害的潛力,Kaiser等[11]研究表明:硅酸鉀的濃度為40 mL/L及更高時可達到抑制腐霉菌的效果。

然而,月桂酸、香芹酚和硅酸鉀對甜瓜粉霉病菌控制效果研究和有關玉金香甜瓜果實粉霉病病原鑒定的研究鮮有報道。本研究首先對玉金香甜瓜果實粉霉病菌進行分離純化,并通過孢子和群體形態(tài)觀察以及分子生物學方法進行病原菌菌種鑒定。以化學殺菌劑嘧菌酯為陽性對照,通過月桂酸、香芹酚和硅酸鉀三種藥物對粉霉病病原菌進行體外抑菌試驗,以期探明三種藥物對甜瓜粉霉病菌抑菌效果。旨在為篩選控制甜瓜粉霉病的新型安全藥物提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發(fā)粉霉病的玉金香甜瓜果實 寧夏中衛(wèi)市興仁鎮(zhèn)甜瓜種植農(nóng)田;月桂酸(99.5%)、硅酸鉀 上海麥克林生化科技有限公司;香芹酚(98.0%) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;B1-220A雙筒生物顯微鏡、BA210-T生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司;Multiskan Go全波長酶標儀 北京九宇金泰生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 參照馬文平等[12]方法略作修改。取有典型病害癥狀的甜瓜,無菌刀片切取病健交界處的組織(5 mm×5 mm),無菌超凈工作臺上依次在70%的酒精中浸洗3～5 s,0.1%的升汞中消毒30～45 s,然后用無菌水連續(xù)漂洗3次去除殘余升汞,滅菌的吸水紙吸去多余的水分后放在事先備好的PDA平板上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。用無菌水配制孢子懸浮液,稀釋至每滴溶液中含有2～3個孢子。將配制的孢子懸浮液取10 μL于PDA培養(yǎng)基進行涂布,28 ℃條件培養(yǎng)2～3 d至單個菌落長出,再用打孔器取單個菌落于新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),即可獲得純化的菌株(LC-1701)。隨后將分離純化的菌株在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,加入含0.05% Tween-80 的無菌水10 mL,無菌紗布過濾,制成106個/mL孢子懸浮液,回接至健康的甜瓜果實,每個果實赤道部位用滅菌鐵釘刺破果面，形成四個直徑為5 mm、深為2 mm的接種點,接入10 μL配制好的孢子懸浮液,并用無菌水作對照。將對照與各處理均放入塑料框中,外套PE袋,室溫(25±2) ℃培養(yǎng),每個處理8～10個果實,觀察其發(fā)病情況。

1.2.2 形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學鑒定 參考真菌鑒定手冊等工具書[13-16],以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d連續(xù)觀察菌落形態(tài)變化特征,記錄菌落表面的形態(tài)結構以及培養(yǎng)過程中菌落大小、顏色變化。并觀察有無分生孢子的產(chǎn)生以及分生孢子形態(tài)及產(chǎn)生方式、產(chǎn)孢梗的形態(tài)特征,對分離得到的菌株進行初步鑒定。

1.2.2.2 分子生物學鑒定 將純化后的菌株于PDA培養(yǎng)基28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d,加入10 mL無菌水在無菌環(huán)境下刮取菌絲,按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取真菌基因組DNA,并對 rDNA-ITS 進行 PCR 擴增,擴增引物為通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(3′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5′),引物均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。20 μL反應體系:10×Ex Taq buffer 2.0 μL,5 U Ex Tap 0.2 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL,上下游引物各1.0 μL,模板DNA 0.5 μL,加ddH2O補至20 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共25個循環(huán);72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST程序與已知序列進行比對分析,應用ClustalX 2.1軟件進行ITS序列對比,并利用MEGA 5.0軟件以鄰接法(NJ)構建基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支置信度進行1000次重復分析。

1.2.3 藥物處理對T.roseum菌絲生長的抑制作用 參照徐俊光[17]和李燦嬰等[18]方法略作修改。以硅酸鉀為例,其它兩種藥物及陽性對照嘧菌酯的方法相同。將濃度分別為 0.50、1.00、1.50和2.00 g/L的硅酸鉀(香芹酚濃度分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L;月桂酸濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16 g/L;嘧菌酯濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L)加入已滅菌并冷卻至 60 ℃的PDA培養(yǎng)基中。再取直徑為0.30 cm的菌餅,將菌餅放置于凝固后的培養(yǎng)基中央,于28 ℃避光條件培養(yǎng)。以不加任何藥物的PDA培養(yǎng)基為空白對照,待空白對照菌落擴展至培養(yǎng)皿邊緣時觀察結果,采用十字交叉法測出菌落直徑[6]。按公式(1)計算抑菌率。以抑制率轉化為概率幾率作為縱坐標(y),濃度轉化為濃度對數(shù)為橫坐標(x)做毒力回歸方程,通過方程計算得到EC50,即抑制中濃度。

式(1)

1.2.4 藥物處理對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制作用 參照李大強[19]方法略作修改。以硅酸鉀為例,其它兩種藥物及陽性對照的方法相同。硅酸鉀(香芹酚、月桂酸)分別加入含4 mL PDB培養(yǎng)基的試管中,使其最終濃度分別為0.50、1.00、1.50和2.00 g/L(香芹酚最終濃度分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L,月桂酸最終濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16 g/L;嘧菌酯濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L)，再加入400 μL振蕩均勻的濃度為 1×106個/mL 的孢子懸浮液,于28 ℃搖床培養(yǎng)(200 r/min)15 h后,統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù),方法參照李燦嬰等[18]的方法。每處理各重復隨機觀察3個以上視野,每個視野數(shù)200個孢子,重復3 次。以不添加藥物但加入400 μL孢子懸浮液的PDB培養(yǎng)基為空白對照組,根據(jù)公式(2)和(3)分別計算孢子萌發(fā)率及孢子萌發(fā)抑制率。以抑制率轉化為概率幾率作為縱坐標(y),濃度轉化為濃度對數(shù)為橫坐標(x)做毒力回歸方程,通過方程計算得到EC50。

式(2)

孢子萌發(fā)抑制率(%)=1-孢子萌發(fā)數(shù)

式(3)

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照陶翠等[20]方法略作修改。采用試管倍比稀釋法,以硅酸鉀為例,另外兩種藥物方法相同。將2 mL 4.00 g/L的硅酸鉀(香芹酚0.16 g/L、月桂酸0.32 g/L、嘧菌酯0.8 g/L)的藥液置于1號試管中,再吸取2 mL最高濃度(4.00 g/L)藥液于試管2號加2 mL稀釋液,從2號試管吸取2 mL稀釋液到試管3,以此類推,直到稀釋到第10管,最后每根試管加入2 mL 105個/mL的孢子懸浮液,第11管為生長對照組(加菌不加藥物),第12管為空白對照管(僅含培養(yǎng)基)。將各試管置于28 ℃(200 r/min)培養(yǎng)7 d,在不攪動的情況下肉眼判斷,溶液清晰透明視為真菌完全不生長,取完全不生長管的最低藥物濃度為MIC。

1.2.6 動態(tài)抑菌試驗 參照熊駿等[21]方法并略作修改,取若干的干燥無菌試管于超凈工作臺中,加入經(jīng)滅菌的察氏培養(yǎng)基5 mL,然后加入不同體積的母液藥物配制成含硅酸鉀(0.50、1.00、1.50和2.00 g/L);香芹酚(0.02、0.04、0.06和0.08 g/L);月桂酸(0.04、0.08、0.12和0.16 g/L);嘧菌酯濃度(0.1、0.2、0.4和0.8 g/L)的察氏培養(yǎng)基,再加入200 μL的濃度為106個/mL的孢子懸浮液,無菌橡膠塞好管口做好標記。以加入200 μL 106個/mL菌懸液的察氏培養(yǎng)基作為空白對照,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩(200 r/min)培養(yǎng),每隔1 d用分光光度計在λ=505 nm測定吸光值。重復實驗測定3次,取平均值。以吸光值為縱坐標,培養(yǎng)時間為橫坐標繪制動態(tài)抑菌曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析,計算標準偏差或進行Duncan’s多重差異顯著性分析,p<0.05時為差異顯著。實驗每組重復3次,數(shù)據(jù)采用M±SD表示。

2 結果與分析

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學特征及致病性 粉霉病是甜瓜采后常見的病害之一,自然發(fā)病癥狀如圖1A所示,發(fā)病初期呈圓形或者橢圓形白色絮狀霉點,后期形成厚重的粉色霉層。將分離純化得到的病原菌在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng),菌落初呈白色、粉狀或絮狀,后逐漸變成粉紅色(圖1B),背面呈米黃色(圖1C)。分生孢子梗(圖1D)無色、直立、不分枝,頂端稍膨大。分生孢子(圖1E)頂生,倒洋梨形,1個隔膜、隔膜處稍縊縮,著生痕在分生孢子基端或其一側?；亟硬≡? d后甜瓜果實表面出現(xiàn)明顯癥狀(圖1F),進一步分離純化得到的病原與之前接種的病菌一致,符合科赫法則[12],證明該菌株(LC-1701)為致病菌。

圖1 粉霉病發(fā)病癥狀及LC-1701形態(tài)Fig.1 Symptoms of pink rot and morphology of LC-1701

2.1.2 病原菌的分子生物學鑒定 將該病原菌的ITS區(qū)測序結果在NCBI網(wǎng)站進行比對,從Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中搜索相似度達90%以上的同源序列,通過MEGA 5.05軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結合形態(tài)學特征、致病性測定及分子鑒定,確定引起甜瓜粉霉病的病原為粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)。

圖2 LC-1701系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of LC-1701

2.2 藥物處理對T.roseum菌絲生長的抑制效果

三種藥物對T.roseum菌落直徑擴展的影響如表1所示。由表1可知三種藥物處理對于病原菌T.roseum的菌落直徑均有抑制作用,且隨著濃度的增長,三種藥物的抑制率也隨之增長:硅酸鉀KSI濃度為2.00 g/L時,抑制率為65.94%;香芹酚Xq濃度為0.08 g/L,抑制率為68.60%;月桂酸LA濃度為0.16 g/L,抑制率就達到80.41%。但是三種藥物與陽性對照嘧菌酯相比,抑菌率均偏低,其中月桂酸的抑菌率最接近于嘧菌酯的抑菌率。三種藥物的最大濃度抑制效果總體趨勢為LA>Xq>KSI。

表1 不同藥物濃度對T.roseum生長的影響Table 1 Effect of different chemical concentrations on the growth of T. roseum

三種藥物濃度對數(shù)與病原真菌T.roseum的抑制率轉化概率之間存在著一定的線性關系,線性方程如表2所示。從表2中可以看出決定系數(shù)R2均大于0.90,表明線性相關性良好。EC50數(shù)值的大小可以反映藥劑對菌絲的毒性大小,數(shù)值越小表示毒性越強。三種藥物中對于致病真菌菌絲的毒性均低于陽性對照嘧菌酯,其中香芹酚對致病真菌菌絲的毒性最接近陽性對照嘧菌酯,且三種藥物對T.roseum毒性由強弱為Xq>LA>KSI。

表2 不同藥物對T.roseum菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibition of different chemicals on the hyphae growth of T. roseum

2.3 藥物處理對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制效果

三種藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的影響如表3所示。從表3可知,三種藥物對T.roseum孢子萌發(fā)抑制率隨著藥物濃度的提高而增大。KSI濃度為2.00 g/L(Xq濃度為0.08 g/L,LA濃度為0.16 g/L)時,對孢子萌發(fā)抑制率分別為:61.24%(70.04%、77.53%),但是三種藥物與陽性對照嘧菌酯相比,對T.roseum孢子萌發(fā)的抑菌率均偏低,其中月桂酸的抑菌率最接近于陽性對照嘧菌酯的抑菌率。三種藥物的最大濃度抑制效果總體趨勢為LA>Xq>KSI,該結果與三種藥物對T.roseum菌絲生長的抑制效果結果一致。

表3 不同濃度藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different concentrations of chemical on the spore germination of T. roseum

三種藥物濃度對數(shù)與病原真菌T.roseum的抑制率轉化概率之間存在著一定的線性關系,線性方程如表4所示。毒力回歸方程直線斜率可以反映病原菌對藥劑的敏感性,斜率越大表明敏感性越強。由表4的數(shù)據(jù)可得T.roseum對于三種藥物的敏感程度均強于陽性對照嘧菌酯,T.roseum對于三種藥物的敏感程度由強至弱依次為Xq>KSI>LA。

表4 不同藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制作用Table 4 Inhibition of different chemicals on the spore germination of T.roseum

2.4 最小抑菌濃度(MIC)

MIC表示最小抑菌藥物濃度,數(shù)值越小,表明T.roseum對于該藥物越敏感。由表5可得出,KSI、Xq和LA三種藥物的MIC分別為1.50、0.08和0.12 g/L,說明T.roseum對Xq和AZX最敏感,LA次之,KSI最不敏感。

表5 不同藥物的最小的抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of different chemicals

2.5 三種藥物的動態(tài)抑制效果

由圖3可知,三種藥物在不同時間段與對照組吸光值相差較大。隨著時間的增加,含藥培養(yǎng)基與CK的OD505值均在增加,培養(yǎng)時間為1～2 d時,OD505值顯著增加(p<0.05),2 d后OD505值均趨于穩(wěn)態(tài)。培養(yǎng)時間為1 d時,各含藥培養(yǎng)基與CK相比,OD505值沒有顯著差異。而從2 d開始,含藥培養(yǎng)基與CK的吸光度值出現(xiàn)明顯差異,CK的OD505值顯著大于三種含藥培養(yǎng)基的OD505值(p<0.05),說明培養(yǎng)2 d開始,三種藥物均對病原菌T.roseum產(chǎn)生抑制作用。

圖3 不同藥物處理對T.roseum吸光度的影響Fig.3 Effect of different chemicals treatments on the absorbance of T. roseum注:同一時間標有不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。

3 討論與結論

采用形態(tài)學和分子生物學相結合的方法,確定了引起玉金香甜瓜粉霉病的病原菌為T.roseum。該結果與梨[22]、葡萄[23]、番茄[24-25]、菜豆[26]和辣椒[27]等果蔬發(fā)生粉霉病害的病原菌鑒定結果一致。形態(tài)學鑒定中該菌的形態(tài)特征與龍眼[28]和番茄[29]紅粉病的病原菌的分生孢子形態(tài)特征基本一致。且發(fā)病癥狀與棗果實[4]和番茄果實[5]發(fā)病癥狀一致,均呈現(xiàn)前期為水浸狀斑,初期呈圓形或橢圓形的白色絮狀霉點;后期形成較厚的粉狀霉層,嚴重時霉層密布整個果面,致使果實發(fā)硬、發(fā)苦。

硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物對T.roseum的菌絲擴展和孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增加,抑菌效果增強。當硅酸鉀在濃度為2.00 g/L對T.roseum的菌絲擴展和孢子萌發(fā)抑制率分別為65.94%和61.24%;月桂酸0.08 g/L對T.roseum的菌絲擴展和孢子萌發(fā)抑制率分別為68.60%和70.04%;0.16 g/L對T.roseum的菌絲擴展和孢子萌發(fā)抑制率分別為80.41%和77.53%。該結果與富饒等[6]和王新偉等[8]研究結果一致。王毅等[30]研究發(fā)現(xiàn)硅酸鈉可通過直接抑菌和誘導果實抗性來抑制杏的粉霉病。牛黎莉等[31]發(fā)現(xiàn)硅酸鈉之所以能夠抑制T.roseum孢子萌發(fā)和菌落生長,其主要原因是硅酸根離子對其孢子結構的破壞。蔣增良等[32]研究結果表明:月桂酸的衍生物月桂酸單甘油酯的抑菌機理主要是通過影響細胞壁、細胞膜、代謝酶及蛋白質合成系統(tǒng)等細胞亞結構來實現(xiàn)。潘永梅[33]發(fā)現(xiàn)香芹酚能夠抑制由炭疽病菌引起的批把果實腐欄的原因是間接提高果實抗氧化能力和抗病性以及直接抑菌作用三方面協(xié)調作用的結果。Ultee 等[34-35]研究結果表明,香芹酚可使微生物膜流動性增強,導致質子和鉀離子滲漏,致使膜電位崩潰以及ATP 的合成受到抑制。由此可知,硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物具有控制甜瓜果實粉霉病的潛力,但其對果實的體內(nèi)作用效果以及抑菌機理均有待進一步研究。

綜上可知,甜瓜粉霉病病原菌是T.roseum;硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物對該菌均有體外抑制效果,且香芹酚抑菌效果最佳;三種藥物均具有控制甜瓜粉霉病的潛力。