毛 毛,侯 虎,郭 紅,衣美艷

(1.山東東方海洋科技股份有限公司,國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)中心分中心,山東煙臺 264003; 2.中國海洋大學(xué),山東青島 266003)

由海參腸壁、呼吸樹與海參性腺等組成的海參內(nèi)臟是鮮活海參加工的主要廢棄物。研究表明海參多肽具有抗氧化、降血壓等生物活性[1-3]。海參內(nèi)臟除蛋白質(zhì)外,富含多糖、皂苷、磷脂、多酚類、黃酮類等活性物質(zhì)[4-5]。海參性腺風(fēng)味獨(dú)特,中國少數(shù)沿海地區(qū)與日本等國家與地區(qū)將其作為昂貴滋補(bǔ)品;而腸臟等內(nèi)臟由于氣味特殊、口感苦麻刺激,難以加工利用[6]。海參內(nèi)臟多肽是目前市場上主要的海參內(nèi)臟功能性制品,感官接受度普遍較差,影響其進(jìn)一步加工應(yīng)用。為提高海參內(nèi)臟肽的感官接受度,通常采取對原料進(jìn)行漂洗或熱處理的方式來脫除不良?xì)馕杜c口感,然而這樣的處理方式易造成水溶性成分的大量損失,且感官優(yōu)化效果有限。

脂肪酶是一種廣泛存在于植物、動物和微生物中的生物催化劑,其天然作用底物為三脂酰甘油酯,能水解酯鍵,生成游離脂肪酸;能夠催化酯化、酯交換及轉(zhuǎn)酯化反應(yīng),已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑等行業(yè)[7-8]。目前在食品工業(yè)中,脂肪酶主要應(yīng)用于油脂改性、奶制品與肉制品的風(fēng)味促進(jìn)、烘焙制品的質(zhì)地改善等[9-11]。以棕櫚油為底物,經(jīng)脂肪酶催化與硬脂酸甲酯交酯化作用可合成類可可脂[9]。封莉等[10]證實添加脂肪酶能有效加速中式香腸中的脂肪降解和脂肪氧化,促進(jìn)香腸中脂質(zhì)來源的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成。脂肪酶在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域的應(yīng)用較少,僅局限于作為脫脂劑。海參內(nèi)臟中含有一定量的脂質(zhì),且成分復(fù)雜,本研究擬將脂肪酶應(yīng)用于海參內(nèi)臟多肽的制備中,探討脂肪酶對于海參內(nèi)臟多肽感官性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山東萊州產(chǎn)春季刺參內(nèi)臟 山東東方海洋科技股份有限公司;脂肪酶(1×105U/mL) 南寧龐博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(2×105U/mL) 南寧龐博生物工程有限公司;膠原蛋白酶(2×105U/mL) 丹麥諾維信公司(蘇州)。

HH4恒溫水浴鍋 金壇天瑞公司;CS-10離心機(jī) 鹽城凱特實驗儀器有限公司;色差儀 杭州彩譜科技有限公司;BY-2000噴霧干燥機(jī) 上海秉越公司;JRJ300-SH組織破碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 解凍→組織破碎→一次酶解→二次酶解→滅酶→離心→層析脫鹽→噴霧干燥。

1.2.2 海參內(nèi)臟多肽制備 海參內(nèi)臟多肽的制備方法參照曹榮等[12]的方法,并為適應(yīng)脂肪酶的添加進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。將去除生殖腺的海參內(nèi)臟于15 ℃解凍4 h,轉(zhuǎn)速7000 r/min破碎30 s備用。將破碎后的組織進(jìn)行第一次酶解,料液比1∶4 (w∶w),添加木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%,膠原蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%,在pH6.8條件下50 ℃作用2 h,不滅酶。進(jìn)行第二次酶解,加一定量脂肪酶,對溫度進(jìn)行調(diào)整,在一定的溫度下酶解一定時間,過程中持續(xù)攪拌。酶解結(jié)束后升溫至95 ℃15 min進(jìn)行滅酶處理。將酶解液5000 r/min 25 ℃離心15 min,取上清。對上清液進(jìn)行層析脫鹽。將經(jīng)過脫鹽的液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/4后進(jìn)行噴霧干燥,進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃,出風(fēng)溫度90 ℃,進(jìn)樣量20 mL/min。

1.2.3 感官評定方法 將所得噴霧干燥粉末配制成1%的溶液,隨機(jī)選取20名非專業(yè)技術(shù)人員組成評價小組,男女各10人,年齡25～40歲,以0.5分為評分區(qū)間,分別對溶液的氣味與口感進(jìn)行評價并打分,計算平均分,取兩位有效數(shù)字。評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard of sensory evaluation

1.2.4 單因素實驗 固定第二次酶解溫度為40 ℃,酶解時間為2 h,將脂肪酶用量設(shè)置為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.00%、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.16%,對脂肪酶用量進(jìn)行單因素實驗;固定酶解時間為2 h,固定脂肪酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%,將第二次酶解溫度設(shè)置為20、30、40、50、60 ℃,對第二次酶解溫度進(jìn)行單因素實驗;固定酶解溫度為40 ℃,固定脂肪酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%,將第二次酶解時間設(shè)置為1、1.5、2、2.5、3 h,對第二次酶解時間進(jìn)行單因素實驗。以上單因素實驗均以感官評價分?jǐn)?shù)為指標(biāo),研究脂肪酶對海參內(nèi)臟多肽氣味與口感的影響。感官評價方法見1.2.3。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計方案,脂肪酶用量(A)、第二次酶解溫度(B)和第二次酶解時間(C)為試驗因素,并以1、0、-1分別代表變量的水平,以感官評價得分作為響應(yīng)值,試驗因素與水平設(shè)計見表2。應(yīng)用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和響應(yīng)面分析。感官評價方法見1.2.3。

表2 響應(yīng)面分析試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of the response surface design

1.2.6 與漂洗法對比實驗樣品制備 目前公開的文獻(xiàn)大多僅提及前處理過程中進(jìn)行清洗,未對清洗方法做詳細(xì)公開[13],本研究參照工業(yè)常規(guī)漂洗方法,綜合考慮產(chǎn)率與風(fēng)味,對漂洗方法進(jìn)行了設(shè)計。對去除生殖腺的海參內(nèi)臟原料進(jìn)行漂洗,共漂洗3次,每次水量為原料質(zhì)量的5倍,漂洗時間30 s。將漂洗后的原料按照1.2.2的方法進(jìn)行海參多肽制備,唯一的區(qū)別是酶解過程不添加脂肪酶,僅使用蛋白酶進(jìn)行酶解,其他條件參照1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最優(yōu)條件,標(biāo)記為樣品1。通過1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最優(yōu)條件制備的樣品,標(biāo)記為樣品2。對樣品1與樣品2的感官評價得分、色澤、產(chǎn)率進(jìn)行比較。

1.2.7 色澤測定和產(chǎn)率計算 色澤使用色差儀進(jìn)行測量。產(chǎn)率計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

除響應(yīng)面試驗外,上述所有試驗均重復(fù)三次,取平均值。響應(yīng)面分析軟件為Design-Expert V8.0.6.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 脂肪酶用量對感官評價分?jǐn)?shù)影響 由圖1可知,未使用脂肪酶的情況下,海參內(nèi)臟多肽的氣味與口感得分均在2分以下,感官評價較差,具有濃重的刺激性氣味和明顯的苦澀麻辣口感,且腥味較重,對多數(shù)人來說感官上難以接受。隨著脂肪酶用量的增加,氣味最先得到改善,在用量0.03%時即得到4分,基本上解決刺激性氣味的問題;用量0.06%及以上時,氣味得分趨于穩(wěn)定,基本不再上升。口感得分的規(guī)律與氣味得分不同,其改善滯后于氣味得分,在用量0.09%時達(dá)到峰值,苦澀麻辣口感基本消失,腥味輕,同時具有濃郁的海參特征風(fēng)味;用量進(jìn)一步提高時,海參特征風(fēng)味也趨于弱化直至消失,導(dǎo)致評分下降。

圖1 脂肪酶用量對海參多肽感官得分影響Fig.1 Effect of lipase mass fraction on sea cucumber viscera polypeptide

2.1.2 第二次酶解溫度對感官評價分?jǐn)?shù)影響 脂肪酶是一類適用溫度范圍較廣的酶,多數(shù)脂肪酶的最適溫度在30～60 ℃,在較高和較低溫度下仍具有較高活性[14]。由圖2可知,脂肪酶在酶解溫度30～60 ℃范圍內(nèi)對海參內(nèi)臟多肽的氣味與口感均具有明顯的優(yōu)化作用,在40 ℃時獲得最高感官評分。

圖2 第二次酶解溫度對海參多肽感官得分影響Fig.2 Effect of second enzymolysis temperature on sea cucumber viscera polypeptide

2.1.3 第二次酶解時間對感官評價分?jǐn)?shù)影響 根據(jù)圖3,可發(fā)現(xiàn)酶解時間對海參內(nèi)臟多肽風(fēng)味優(yōu)化作用的影響與脂肪酶用量趨勢類似,氣味與口感得分在作用2 h時即達(dá)到平穩(wěn)不再下降,而口感得分在2 h時達(dá)到峰值,隨后因海參特征風(fēng)味的弱化導(dǎo)致評分下降。

圖3 第二次酶解時間對海參多肽感官得分影響Fig.3 Effect of second enzymolysis time on sea cucumber viscera polypeptide

海參內(nèi)臟多肽的不良風(fēng)味機(jī)理尚不明確,就目前研究所知,可能與體系成分復(fù)雜、酶解過程中多肽疏水基團(tuán)暴露、皂苷與多糖等活性物質(zhì)含量豐富等原因有關(guān),同時具有腥味[4,6]。高子陽等[15]將味苦麻舌的格皮氏海參切片提取過皂苷后,其麻舌感消失,因此推測麻舌感的來源可能為含量豐富的皂苷。海參內(nèi)臟中皂苷含量遠(yuǎn)高于體壁,在1%以上[4],可推測豐富的皂苷是海參內(nèi)臟多肽風(fēng)味不良的原因之一。

脂肪酶的作用產(chǎn)物通常不是單一的,原因主要是脂肪酶催化的化學(xué)反應(yīng)種類較多,并且都為可逆反應(yīng),而且反應(yīng)可能不完全[9]。脂肪酶在海參內(nèi)臟多肽酶解反應(yīng)的過程中發(fā)生復(fù)雜的酯解、酯交換、醇解、酸解、糖苷鍵解離等反應(yīng),有可能包括皂苷糖苷鍵的水解,導(dǎo)致苦味與麻澀口感的消失;同時解離出的游離脂肪酸有利于體系的乳化,對不良風(fēng)味具有包埋作用。脂肪酶具有界面激活特性,當(dāng)處于油水界面時,“蓋子”結(jié)構(gòu)疏水側(cè)暴露于脂相中,“蓋子”打開,脂肪酶露出一個大的疏水表面[16-17]。因此反應(yīng)可能形成與苦味肽疏水基團(tuán)的疏水相互作用,促進(jìn)包裹于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水片段的暴露,使疏水氨基酸加速酶解,從而降低苦味。反應(yīng)解離出游離脂肪酸,在攪拌作用下促進(jìn)了體系的乳化,促進(jìn)了不良風(fēng)味的掩蔽。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 多元回歸結(jié)果分析 以感官評價分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析,試驗方案及結(jié)果見表3,回歸分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design and results

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis

利用Design Expert軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到感官評價分?jǐn)?shù)對脂肪酶用量(A)、第二次酶解溫度(B)、和第二次酶解時間(C)的二次多項回歸模型:

Y=9.36+0.18A+0.66B+0.44C+0.050AB-0.25AC+0.025BC-0.34A2-1.47B2-0.52C2

由表4可知,回歸模型極顯著(p<0.01);而失擬項不顯著(p=0.1511),表明該模型擬合程度良好。方程決定系數(shù)R2=0.9748,方程校正系數(shù) AdjR2=0.9423,擬合優(yōu)度較高。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明可以用此模型來對脂肪酶優(yōu)化海參內(nèi)臟多肽提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。從表5可以看出,B、C、B2、C2對結(jié)果的影響極顯著(p<0.01),A2對結(jié)果的影響顯著(p<0.05),A對結(jié)果的影響不顯著,但<0.1。交互項AB、AC、BC對結(jié)果的影響均不顯著。對感官評價分?jǐn)?shù)影響的大小依次為第二次酶解溫度(B)>第二次酶解時間(C)>脂肪酶用量(A)。

2.2.2 感官評價分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 應(yīng)用 Design Expert 軟件,繪制響應(yīng)面圖。比較3組圖可知,第二次酶解溫度與第二次酶解時間對海參內(nèi)臟多肽感官評價的影響均為極顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,而脂肪酶用量的影響相對較小;3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面,說明響應(yīng)值存在極大值。結(jié)合二次回歸模型的分析結(jié)果,感官評價得分最高的工藝參數(shù)為脂肪酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%,第二次酶解溫度42.31 ℃,第二次酶解時間2.20 h,得分為9.53分。根據(jù)實際條件,選擇脂肪酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%,第二次酶解溫度42 ℃,第二次酶解時間2.2 h。以此為實驗條件進(jìn)行回歸驗證,得到的氣味得分為4.9分,口感得分為4.7分,總分9.6分,與回歸分析得到的結(jié)果基本一致。試驗結(jié)果表明,脂肪酶應(yīng)用于海參內(nèi)臟多肽的風(fēng)味優(yōu)化具有顯著的效果,有效消除產(chǎn)品的刺激性氣味與苦澀麻辣口感,同時具有海參特征風(fēng)味。

2.3 與漂洗法對比結(jié)果分析

由表5可知,將原料預(yù)先進(jìn)行多次漂洗的方法對于海參內(nèi)臟多肽的風(fēng)味優(yōu)化具有一定的作用,可部分消除產(chǎn)品的腥味,但是對于刺激性氣味與苦澀麻辣的口感作用有限;漂洗法得到的產(chǎn)品為淺褐色,顏色較深;漂洗造成了活性成分的大量損失,產(chǎn)率不理想。使用脂肪酶法對海參內(nèi)臟多肽進(jìn)行感官優(yōu)化,可在降低腥味的同時有效消除產(chǎn)品的刺激性氣味與苦澀麻辣口感,使產(chǎn)品變得柔滑適口;與漂洗法相比,產(chǎn)品的色澤也得到了一定的改善,為米色或深米色,與漂洗法相比更偏向紅色調(diào)與黃色調(diào),色澤較為明亮,這可能是因為解離出的游離脂肪酸增進(jìn)了乳化作用,或者酚類物質(zhì)與游離脂肪酸結(jié)合避免了氧化所導(dǎo)致的;產(chǎn)率較理想,接近漂洗法的二倍。

表5 脂肪酶法與漂洗法對比結(jié)果Table 5 Comparison between methods with lipase and rinsing

圖4 脂肪酶用量與第二次酶解溫度 對海參內(nèi)臟多肽感官評價的影響Fig.4 Effect of lipase mass fraction and second enzymolysis temperature on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

圖5 脂肪酶用量與第二次酶解時間 對海參內(nèi)臟多肽感官評價的影響Fig.5 Effect of lipase mass fraction and second enzymolysis time on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

圖6 第二次酶解溫度與第二次酶解時間 對海參內(nèi)臟多肽感官評價的影響Fig.6 Effect of second enzymolysis temperature and second enzymolysis time on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

3 結(jié)論

本文將脂肪酶應(yīng)用與海參內(nèi)臟多肽的制備,通過感官鑒定實驗,證實可有效修正其不良口感,改善其感官性狀。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為脂肪酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%,第二次酶解溫度42 ℃,第二次酶解時間2.2 h,得分為9.6分。與工業(yè)中常規(guī)應(yīng)用的漂洗法相比,本方法氣味、口感感官鑒定得分,色澤、產(chǎn)率均得到優(yōu)化與提升,可以此為依據(jù)對海參內(nèi)臟多肽生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn),使其成為優(yōu)質(zhì)的功能性食品、保健食品、醫(yī)用食品原料。本文首次將脂肪酶應(yīng)用于海洋多肽制品的優(yōu)化,拓展了其應(yīng)用范圍。然而,感官性狀改善機(jī)理尚不完全明確,也未進(jìn)行實驗驗證,僅通過文獻(xiàn)查閱及實驗結(jié)果分析推測為皂苷、風(fēng)味不良脂質(zhì)的分解與交酯化、乳化作用導(dǎo)致,還有待進(jìn)一步研究。