牛婧娥,吳國泰,杜麗東,李 倩,史彥斌,*,任 遠,*

(1.蘭州大學藥學院,甘肅蘭州 730000; 2.甘肅中醫(yī)藥大學,甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

當歸潤腸組方由當歸、枳殼、干姜、大棗組成,具有養(yǎng)血溫陽、潤腸導滯的功能;主治血虛、寒凝、瘀滯之冷秘。課題組之前將其制成當歸潤腸茶,發(fā)現(xiàn)高劑量能顯著縮短脾胃虛寒型便秘小鼠、慢傳輸型便秘小鼠、陰虛血瘀型模型小鼠的排便時間(p<0.05),并能顯著增加脾胃虛寒型便秘小鼠、慢傳輸型便秘小鼠、陰虛血瘀型模型小鼠的排便量、糞便含水量和腸推進率(p<0.05)。按最高濃度最大給藥容量灌胃后,當歸潤腸茶對小鼠未見明顯急性毒性反應[1]。然而,當歸潤腸茶久置易出現(xiàn)渾濁,口感變差,質量不穩(wěn)定。因此,嘗試將其制成質量穩(wěn)定的物理形態(tài)是本論文關注的核心內容。

煎膏劑是傳統(tǒng)滋補型中藥制備中的常用劑型。其服用口感好、體積小,滲透壓高、不易發(fā)霉變質,適合長期服用及胃腸道不健全的病人,已成為保健食品的一種重要物理形態(tài)[2-8]。因此,將當歸潤腸方開發(fā)為煎膏劑(簡稱:當歸潤腸膏),穩(wěn)定性應較茶劑有較大提升,市場前景更加樂觀。

本論文擬以浸膏出膏得率、浸出物含量、多糖含量、阿魏酸含量為評價指標,采用三因素三水平L9(34)正交試驗優(yōu)選當歸潤腸膏的最佳提取工藝。通過煉蜜及煎膏劑的相對密度,確定清膏濃縮的程度,制備煎膏劑。通過影響因素和經典恒溫法實驗,考察其穩(wěn)定性,以期為配方調整、貯存條件和保質期的制定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當歸(RadixAngelicaeSinensis)、干姜(ZingibeaisRhizoma)、枳殼(AurantiiFrucrus)、大棗(JujubaeFructus) 甘肅隴西縣百寶藥業(yè)有限責任公司 均符合《中國藥典》2015版I部對藥材的質量要求;蜂蜜 甘肅景泰田金剛蜂業(yè)有限公司;阿魏酸對照品(批號:15121602)、齊墩果酸對照品(批號:wkq16051205)、6-姜酚對照品(批號:16081803)、新橙皮苷對照品(批號:wkq16041804) 四川省維克奇生物科技有限公司;葡萄糖 北京化學試劑工廠 分析純;色譜甲醇 山東禹王實業(yè)有限公司 分析純;娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;其他試劑 均為市售分析純。

Bench Top6K型凍干機 美國VisTis公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;UV-2501PC/2550紫外可見分光光度計 日本島津;高效液相色譜儀系列 美國Waters公司;M-2-4可調式電熱板 上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司;比重瓶 鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;XK-80A快速混勻器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;TDL-5臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;NDJ/SNB數(shù)字顯示粘度計 上海上天精密儀器有限公司;WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀 天津藥典標準儀器廠;101-2A型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;ZF-2型三用紫外儀 上海安亭電子儀器廠;玻璃點樣毛細管 華西醫(yī)科大學儀器廠;硅膠板 青島海洋化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝優(yōu)化 取粉碎后過30目篩的藥材當歸、枳殼、干姜、大棗以處方量4∶1∶0.25∶4 (w/w)比例均勻混合。加入適量蒸餾水,采用熱回流法進行提取。

1.2.1.1 單因素實驗 參照中藥和食材提取工藝的諸多文獻[9-11],本實驗以出膏得率為考察指標,分別對提取時間、提取次數(shù)及加水量3個因素進行了考察。固定提取次數(shù)為2次,提取時間為每次1.5 h的條件下考察加水量(水/藥材,v/w)為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1對出膏得率的影響;固定加水量為8倍,提取時間為1.5 h,考察提取次數(shù)1、2、3、4和5次對出膏得率的影響;固定加水量為8倍,提取次數(shù)為2次,考察提取時間0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h對出膏得率的影響。

1.2.1.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結果,確定提取時間、提取次數(shù)及加水量為影響因素,每個因素選擇三個水平?？紤]到隨著提取的次數(shù)增多,濾渣中藥物含量不斷減少,為節(jié)約資源,基于前一次的提取條件,適當縮減后一次提取的加水量和提取時間,所以將加水量、提取時間設置3個遞減值,采取梯度設計[12]。以出膏得率、浸出物含量、多糖量、阿魏酸含量的綜合評分為評價指標,按三因素三水平L9(34)進行正交設計(表1),優(yōu)選提取工藝。根據(jù)主成分權重系數(shù)大的原則,以阿魏酸含量為主(權重系數(shù)0.4),出膏得率、浸出物含量、多糖含量為輔(權重數(shù)依次為0.1、0.25、0.25),按公式(1)計算綜合評分。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

M=b1×aij/s1+b2×bij/s2+b3×cij/s3+b4×dij/s4

式(1)

其中,aij、bij、cij、dij為第i項的第j個指標;s1、s2、s3、s4為樣本標準差;b1、b2、b3、b4為權重系數(shù)。

稱取三份處方量的當歸潤腸膏組方,分別按最佳提取工藝條件提取,分析魏酸含量、出膏得率、浸出物含量、多糖含量,計算綜合評分。

1.2.1.3 出膏得率的測定 將提取液過濾,置于蒸發(fā)皿濃縮,真空冷凍干燥至恒重,取出置于干燥器中至室溫,稱量,出膏得率(%)=干膏重×100/藥材重量。

1.2.1.4 浸出物含量的測定 取上述干膏,精密稱定。按照2015年版《中國藥典》第四部中關于浸出物的測定方法(2201,熱浸法)進行測定。

1.2.1.5 多糖含量的測定 精密稱取葡萄糖對照品57.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得114 μg/mL的葡萄糖對照品溶液,將其稀釋為0、22.8、45.6、68.4、91.2、114.0 μg/mL質量濃度的對照品溶液。取各溶液1 mL,加入1 mL的苯酚,再立即加入5 mL的濃硫酸,冷卻至室溫,以蒸餾水為空白對照,于UV-1700可見分光光度計490 nm處測各溶液的吸光度[13]。以濃度(X)為橫坐標,吸光度(Y)為縱坐標線性回歸,即得回歸方程Y=0.0091X-0.0099(R2=0.9991),葡萄糖在0～114.0 μg/mL范圍內與吸光度成良好的線性關系。

取提取液25 mL,加入100 mL無水乙醇,攪拌均勻,使其含醇量達80%,靜置5 min后,以5000 r/min的轉速離心20 min,收集沉淀,真空冷凍干燥,即得干燥近白色的粗多糖,稱重。準確稱取3.0 mg粗多糖,轉移于25 mL的容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,即得供試品溶液[14]。取供試品溶液各1 mL,同上述測定法,求得多糖含量。

1.2.1.6 阿魏酸含量的測定 準確稱取阿魏酸對照品3.5 mg于25 mL的容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得140 μg/mL的對照品溶液,將其稀釋到濃度為0.875、1.75、3.5、7.0、14.0 μg/mL的對照品溶液。精密吸取20 μL注入液相色譜儀測定。色譜柱為Diamonsil C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇:0.1%磷酸(40∶60);柱溫為35 ℃;檢測波長為323 nm[15]。以濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,即得回歸方程Y=121060X-9193.3(R2=0.9996)。阿魏酸在0.875～14.00 μg/mL濃度范圍內與峰面積值成良好的線性關系。

取正交實驗所得提取液1 mL,置25 mL的容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。超聲30 min,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得供試品溶液,同上法測定。

1.2.2 制備工藝研究 按處方量稱取6組藥材,分別依照最優(yōu)提取工藝操作,所得6組平行樣品分別濃縮至用玻璃棒挑動有拉絲現(xiàn)象出現(xiàn),測其相對密度,之后分別與原藥材相同質量的煉蜜(相對密度為1.48,粘度為36117.0 cp)均勻混合,制得6批煎膏劑樣品,分別測定樣品的相對密度,并觀察其流動性。

1.2.3 質量標準研究

1.2.3.1 薄層色譜(TLC)鑒別 按相同的制備工藝平行制備6組當歸潤腸膏,編號為3～8。參照2015年版《中國藥典》第一部中的藥材項下有效成分的鑒別方法[16],對當歸潤腸膏中當歸、大棗、干姜、枳殼進行TLC鑒別。其中,陰性樣品按上述相同制備工藝制備,只是處方中不含有對應檢測的藥材。

1.2.3.2 檢查 結合6批煎膏劑樣品的相對密度測定值,制定本煎膏劑的相對密度為1.32～1.37。其它應符合煎膏劑項下有關的各項規(guī)定(參照《中國藥典》2015年版第四部附錄通則0183)。

1.2.3.3 阿魏酸含量測定 測定方法同“1.2.1.6”項下的阿魏酸含量測定方法。分別對實驗中6批樣品進行含量測定,每批樣品平行測定3次。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

1.2.4.1 影響因素試驗 將按照最優(yōu)工藝制備的樣品分成兩份,取適量分別裝在棕色和透明磨口玻璃瓶中,置于20 ℃、4500 lx光照條件的藥物穩(wěn)定性檢查儀中,于第0、5、10 d取樣,按《中國藥典》2015年版四部(通則)煎膏劑項下有關的各項規(guī)定進行檢測,包括性狀、相對密度、不溶物、阿魏酸含量。另取所制樣品置于棕色玻璃瓶中,在60 ℃烘箱中放置10 d,于第0、5、10 d取樣分析。

1.2.4.2 恒溫加速試驗 將按照最優(yōu)工藝制備的樣品分成兩份,其中一份加入終濃度為0.4%(w/w)的NaHSO3和0.1%(w/w)的EDTA-2Na作為穩(wěn)定劑,轉移到棕色玻璃瓶中,分別放置在60、70、80、90 ℃的烘箱中,按設定時間取樣,取出后迅速降溫至室溫,按供試品溶液的制備方法處理,測定樣品中阿魏酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加水量的影響 由圖1可知,出膏得率隨加水量的增加而出現(xiàn)升高的趨勢,但當加水量為原藥材質量的8倍以上時,出膏得率基本維持穩(wěn)定,且在前3個水平間出膏得率均具有顯著性差異(p<0.05)。當加水量為10倍時出膏得率有所下降,很有可能是因為過多的水份導致濃縮過程中產生損耗。綜合水的消耗量及出膏得率,選擇加水量的中心水平為原藥材質量的10倍。

圖1 加水量對出膏得率的影響Fig.1 Effect of volume of water on extract yield

2.1.2 提取次數(shù)的影響 由圖2可知,提取次數(shù)由1次增加到2次時,出膏得率顯著(p<0.05)增加。當提取次數(shù)大于2次時,隨提取次數(shù)的增加,出膏得率增加,但其增加幅度并不顯著,基本維持在66%～70%之間。基于實際生產和成本角度考慮,確定提取次數(shù)的中心水平為2次。

圖2 提取次數(shù)對出膏得率的影響Fig.2 Effect of the number of extract on extract yield

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,出膏得率不斷增加,且在前3個水平間出膏得率均具有顯著性差異(p<0.05),這可能是因為提取不完全。之后隨時間延長,出膏得率增加緩慢,基本保持不變。所以確定提取時間的中心水平為1.5 h。

圖3 提取時間對出膏得率的影響Fig.3 Effect of extract time on extract yield

2.2 正交試驗結果

對評價指標進行綜合評分,具體結果見表2。由方差分析(表3)可知,A、B、C因素差異均不顯著(p>0.05)。由表2直觀分析可知,A、B、C均對綜合評分有影響,極差B>A>C(R=4.08>2.47>1.99),故影響試驗結果的主次因素順序為B>A>C。A因素中A2>A3>A1,選擇因素最好水平A2;B因素中B3>B2>B1,其中B2與B3相差不多,考慮到節(jié)能,選擇因素水平B2;C因素中C3>C1>C2,選擇因素最好水平C3。綜合考慮,并結合生產實際,確定A2B2C3為最佳提取條件,即:第一次加水10倍量,浸泡1.25 h,回流提取2 h;第二次加水8倍量,回流提取1.5 h。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal tests

表3 綜合評分的方差分析Table 3 Analysis variance of comprehensive evaluation

2.3 最佳提取工藝驗證

采用最佳提取工藝條件,平行操作,得到3批浸膏樣品,其出膏得率、浸出物含量分別為64.24%±0.99%、21.43%±0.68%,多糖、阿魏酸含量分別為(7.78±0.03)、(4.05±0.24) mg/mL,綜合評分M為7.13±0.25。

2.4 制備工藝結果

當浸膏濃縮至相對密度為1.207±0.008時,與煉蜜(相對密度為1.48,粘度為36117.0 cp)按原藥材質量比1∶1 (w/w)混合。分別測定6批樣品的相對密度,觀察流動性,所得煎膏劑相對密度在1.32～1.37之間,其粘度適中,流動性較好。

2.5 質量標準

2.5.1 性狀 本品為煎膏劑,均為棕褐色稠膏,氣微,味微苦,無糖結晶析出。

2.5.2 薄層色譜(TLC)鑒別

2.5.2.1 當歸TLC鑒別 供試品色譜中,與阿魏酸對照品相應的位置上(Rf=0.2289)顯相同的黃色熒光斑點,在與當歸對照藥材相應的位置上顯示2個相同的黃色熒光斑點,而陰性樣品在對應處均無斑點(見圖4)。

圖4 當歸潤腸膏中阿魏酸的薄層色譜圖Fig.4 Thin layer chromatogram of ferulic acid of DangguiRunchang paste注:1.阿魏酸對照品;2.當歸對照藥材; 3～8.當歸潤腸膏樣品;9.不含當歸藥材制備的陰性膏。

2.5.2.2 大棗TLC鑒別 供試品色譜中,與齊墩果酸對照品相應的位置上(Rf=0.6184)顯相同的褐色斑點,在與大棗對照藥材相應的位置上顯示2個相同的褐色斑點,而陰性樣品在對應處均無斑點(見圖5)。

圖5 當歸潤腸膏中齊墩果酸的薄層色譜圖Fig.5 Thin layer chromatogram of oleanolic acid of DangguiRunchang paste注:1.齊墩果酸對照品;2.大棗對照藥材; 3～8.當歸潤腸膏樣品;9.不含大棗藥材制備的陰性膏。

2.5.2.3 干姜TLC鑒別 供試品色譜中,與6-姜酚對照品相應的位置上(Rf=0.4150)顯相同的褐色斑點,在與干姜對照藥材相應的位置上顯示1個相同的褐色斑點,而陰性樣品在對應處均無斑點(見圖6)。

圖6 當歸潤腸膏中6-姜酚的薄層色譜圖Fig.6 Thin layer chromatogram of 6-gingerol of Danggui Runchang paste注:1.6-姜酚對照品；2.干姜對照藥材； 3～8.當歸潤腸膏樣品;9.不含干姜藥材制備的陰性膏。

2.5.2.4 枳殼TLC鑒別 供試品色譜中,在與新橙皮苷對照品相應的位置上(Rf=0.3428)顯相同的黃色熒光斑點,在與枳殼對照藥材相應的位置上顯示2個相同的黃色熒光斑點,而陰性樣品在對應處均無斑點(見圖7)。

圖7 當歸潤腸膏中新橙皮苷的薄層色譜圖Fig.7 Thin layer chromatogram of hesperidin of Danggui Runchang paste注:1.新橙皮苷對照品；2.枳殼對照藥材； 3～8.當歸潤腸膏樣品；9.不含枳殼藥材制備的陰性膏。

薄層色譜圖中顯示,在當歸潤腸膏中,當歸、大棗、干姜、枳殼的分離效果和顯色效果均良好,在對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,而陰性樣品均在對應處無斑點,表明該法對供試品中各成分有較好的分離,且靈敏度高,專屬性好。

2.5.3 阿魏酸含量 由表4可見,6批當歸潤腸膏樣品中,平均每g樣品含阿魏酸(102±4.4) μg。參照2015年版《中國藥典》當歸藥材項下有效成分最低限量的規(guī)定,阿魏酸的含量不得低于0.05%,則當歸潤腸膏中每g含阿魏酸理論上不得低于108 μg,結合本試驗結果,加上制備過程中的轉移率約為80%,暫定當歸潤腸膏中每g含阿魏酸(C10H10O4)不得少于90 μg。

表4 樣品中阿魏酸含量Table 4 The content of ferulic acid in the sample

2.6 煎膏劑的穩(wěn)定性

2.6.1 影響因素試驗 強光照射下,透明瓶中的樣品氣味發(fā)生變化,阿魏酸含量減少,而在棕色瓶中的樣品氣味和阿魏酸含量基本無變化;高溫環(huán)境下,煎膏劑的性狀發(fā)生改變,氣味變酸,阿魏酸含量隨著時間的推移呈明顯下降趨勢(表5)。因此,當歸潤腸膏在強光和高溫貯藏條件下不穩(wěn)定,應低溫、避光保存。

表5 當歸潤腸膏穩(wěn)定性試驗Table 5 Stability test of DangguiRunchang paste

2.6.2 恒溫加速試驗 用阿魏酸濃度的對數(shù)值(lgC)與取樣時間(t,min)作圖接近直線,擬合度(R2)接近0.99,所以按一級動力學方程(3)計算藥物降解速率常數(shù)(K)。將攝氏溫度改換為熱力學溫度T(T= ℃+273.15)(表6),可以看出隨溫度升高,藥物降解速率常數(shù)(K)值越大,即可根據(jù)阿侖尼烏斯(Arrhenius)方程(2)擬合lgK和1/T[17],得未加穩(wěn)定劑的直線方程為lgK=-5199.1/T+13.2(R2=0.9808),添加穩(wěn)定劑的直線方程為lgK=-6612.61/T+17.0(R2=0.9974)。將室溫25 ℃(T=298 K)分別代入上述直線方程,求出室溫貯藏時的阿魏酸降解速率常數(shù)K,再根據(jù)一級反應方程式(3)計算藥物降解10%所需的時間(t0.9)[18]。結果顯示未添加穩(wěn)定劑的當歸潤腸膏的預測保質期約3個月,而添加穩(wěn)定劑的樣品預測保質期延長至1.68年。由此可知,在當歸潤腸膏中加入0.4%的NaHSO3、0.1%的EDTA-2Na作為穩(wěn)定劑,比不加穩(wěn)定劑的保質期延長了近8倍,能基本滿足生產儲存的要求。

表6 試驗溫度與速率常數(shù)表Table 6 Test temperature and rate constants

lgK=-E/2.303RT+lgA

式(2)

其中：K是反應速率常數(shù);A是頻率因子;E是活化能;R為氣體常數(shù);T是絕對溫度。

lgC=-Kt/2.303+lgC0

式(3)

其中：C0為t=0時的反應濃度,C為t時反應物的濃度。

3 結論

采用正交試驗對當歸潤腸膏的提取工藝進行優(yōu)化,以出膏得率、浸出物、多糖含量和阿魏酸含量四項參數(shù)為評價指標,確定了當歸潤腸膏的最佳提取工藝。本研究中,通過不同相對密度的提取物和不同程度的煉蜜進行混合,觀察所制煎膏劑的黏稠性和流動性,結合實際生產和使用的便利性,進而選擇提取物濃縮的程度和蜂蜜煉制的程度。經3批次的提取工藝驗證和6批煎膏劑樣品的制備,本文報道的提取和制備工藝科學合理,數(shù)據(jù)可靠,適宜于實際生產。

為了保證藥物的安全性和有效性,以及生產流通、使用各個環(huán)節(jié)的影響,本實驗參照2015年版《中國藥典》煎膏劑項下的要求,對當歸潤腸膏進行了全方位的質量標準研究,確定了控制產品質量的項目和限度,制定了科學、合理、可行的并能反映產品特征的和質量變化情況的質量標準,有效的控制了產品批間質量的一致性及驗證生產工藝的穩(wěn)定性。

當歸潤腸膏在強光和高溫環(huán)境下放置10 d后,阿魏酸含量呈明顯下降趨勢,可能是阿魏酸結構中酚羥基在高熱和強光下均易發(fā)生氧化或分子間發(fā)生聚合,導致含量下降,這與文獻報道的研究結果一致[19-21]。因此,在生產和貯存過程中應盡量采用避光措施,在低溫環(huán)境下貯藏。

當歸潤腸膏在恒溫加速試驗中,濃度對數(shù)值與取樣時間的擬合度(R2)接近0.99,提示其降解反應屬于一級動力學過程;另外,溫度越高,速率常數(shù)K值越大,提示降解速率與溫度成正相關,由此可用Arrhenius定律處理。在當歸潤腸膏中加入0.4%的NaHSO3、0.1%的EDTA-2Na作為穩(wěn)定劑,其預測保質期為1.68年,比不加穩(wěn)定劑的樣品保質期延長了8倍,說明穩(wěn)定劑的加入有效抑制了阿魏酸含量的下降。本實驗結果以阿魏酸為標志性成分得出的保質期僅為理論預測值,實際生產可暫定為1.5年?？陀^的保質期需要通過室溫留樣觀察實驗獲得,該實驗仍在進行當中。