鐘麗霞,江震宇,汪嘉妮,李旭楓,徐麗珊

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),薔薇科山楂屬植物,是我國(guó)一種藥食兩用的果品[1]。其種植面積廣,產(chǎn)量可觀,民間常用于降血糖、降血脂。據(jù)報(bào)道,山楂富含多糖、多酚、有機(jī)酸、三萜、甾醇、胡蘿卜素、氨基酸等化學(xué)成分及微量元素[1-3],其中多糖是山楂中一類重要的生物活性物質(zhì)。多糖又稱多聚糖,是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵,并以糖苷鍵線性或分支連接而成的鏈狀聚合物。研究發(fā)現(xiàn),多糖除了可以作為植物的貯藏養(yǎng)料和骨架成分外,還具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力、抑癌、抑菌等一系列重要生物學(xué)功能[4-7]。

近年來,已經(jīng)有學(xué)者對(duì)枸杞多糖[8]、蘆薈多糖[9]進(jìn)行深入研究,表明多糖具有誘人的開發(fā)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。目前對(duì)山楂多糖提取工藝的研究尚少,且現(xiàn)有的研究多是熱水浸提、超聲提取工藝,關(guān)于微波輔助提取山楂多糖工藝的研究很少,鮮有文獻(xiàn)對(duì)優(yōu)化提取工藝后提取的山楂多糖進(jìn)行進(jìn)一步的活性探究。微波輔助提取技術(shù)[10]是國(guó)內(nèi)外常用的植物活性成分提取技術(shù),其主要是依靠微波加速活性成分的溶出。人體內(nèi)血糖及血脂的代謝過程受多種酶的調(diào)控,通常以酶為靶標(biāo),研究各類活性物質(zhì)對(duì)血糖、血脂代謝的作用[11]。

因此,本試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取山楂多糖的工藝條件,并通過體外測(cè)定山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的活性及DPPH·清除能力,研究其降血糖、降血脂活性,以期為山楂資源的開發(fā)利用及山楂源保健產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂(山里紅) 浙江金華醫(yī)藥公司,新鮮山楂去核后放入60 ℃烘箱中,烘干至恒重,粉碎機(jī)粉碎過篩,貯存于干燥環(huán)境中待用;1,1-二苯-2-苦肼基(DPPH·)、胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、膽酸鈉及?；悄懰徕c 美國(guó)Sigma公司;無水乙醇、正丁醇、氯仿等有機(jī)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FW135粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科技有限公司;BSA-224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;MDS-8G微波消解儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山楂粗多糖的提取 采用微波輔助提取乙醇沉淀法提取山楂多糖。山楂粉采用石油醚以1∶2 (g/mL)的料液比萃取除去脂溶性物質(zhì),每次15 min，重復(fù)三次,抽濾烘干。一定質(zhì)量的山楂粉和去離子水按一定固液比(g/mL)充分混勻后,進(jìn)行微波輔助提取,提取液于4 ℃,4500 r/min離心10 min,取上清液濃縮、干燥后復(fù)溶于一定量的去離子水,按四倍體積的量加入無水乙醇沉淀12 h;4500 r/min離心20 min,沉淀烘干得到山楂多糖提取物。將山楂多糖提取物復(fù)溶于去離子水中,以液固比3∶1 (mL/g)用活性炭吸附法除色素;取脫色素后的樣品液以樣品液與Sevag試劑體積比3∶1在恒溫水浴搖床振蕩(200 r/min)20～30 min,400 r/min離心20 min,取少量上清液測(cè)定蛋白的質(zhì)量,重復(fù)處理5次,除蛋白后冷凍干燥得到山楂粗多糖。

1.2.2 多糖提取物提取量測(cè)定及多糖含量測(cè)定 多糖提取物提取量計(jì)算公式如下:

多糖提取物提取量(mg/g)=a/m

式中:a為山楂多糖提取物的質(zhì)量,mg;m為除去脂溶性物質(zhì)后山楂粉的質(zhì)量,g。

多糖含量測(cè)定[12]:取1 mL山楂粗多糖溶液于試管中,浸于冰浴中冷卻,再加入4 mL蒽酮試劑,沸水浴10 min,取出用自來水冷卻后比色。用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液代替山楂粗多糖溶液制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:y=10.056x+0.0113,R2=0.997,y為待測(cè)液糖質(zhì)量濃度,x為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。測(cè)得的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查算出山楂粗多糖溶液的糖含量。多糖含量按照以下方程進(jìn)行計(jì)算:

W(%)=CV/m×100

式中,W為糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù),C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品稀釋后的體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,mg。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取功率對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,提取時(shí)間9 min,固液比1∶30 (g/mL),考察不同微波功率(300、400、500、600、700 W)對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,固液比1∶30 (g/mL),固定微波功率500 W,考察不同提取時(shí)間(3、6、9、12、15 min)對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 固定微波功率500 W,提取時(shí)間6 min,固液比1∶30 (g/mL),考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.4 固液比對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,提取時(shí)間6 min,固定微波功率500 W,考察不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g/mL))對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化山楂多糖提取物的提取工藝。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,并綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、提取功率(C)為3個(gè)影響因素,以山楂多糖提取量為響應(yīng)值。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0,建立3因素3水平的響應(yīng)面分析法,進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 山楂粗多糖降血糖、降血脂活性測(cè)定

1.2.5.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 50 μL山楂粗多糖溶液與50 μLα-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL)(以pH6.8磷酸鉀緩沖鹽配制)混勻后,于37 ℃水浴鍋上溫浴5 min,再加入100 μL 5 mmol/L 以相同緩沖鹽配制的對(duì)硝基苯基葡萄糖苷(PNPG)溶液進(jìn)行反應(yīng),于405 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的酶動(dòng)力曲線。以等量的pH6.8磷酸鉀緩沖鹽溶液代替樣品溶液作為空白組,同樣操作,測(cè)得反應(yīng)體系的酶動(dòng)力曲線[13]。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。按照以下方程計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

抑制率(%)=(1-k1/k2)×100

式中,k1和k2分別是樣品組和空白組酶動(dòng)力曲線斜率k值。

1.2.5.2 胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定 取50 μL山楂粗多糖溶液與100 μL酶液(以pH8.0 Tris-HCl緩沖液配制)混勻后,置于37 ℃恒溫箱內(nèi)預(yù)熱5 min,然后注入100 μL底物溶液,于405 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的酶動(dòng)力曲線。以等量的Tris-HCl緩沖溶液代替樣品溶液作為空白組,同樣操作,測(cè)得反應(yīng)體系的酶動(dòng)力曲線[14]。以?shī)W利司他為陽(yáng)性對(duì)照。按照以下方程計(jì)算胰脂肪酶活性抑制率。

抑制率(%)=(1-k1/k2)×100

式中,k1和k2分別是樣品組和空白組的酶動(dòng)力曲線斜率k值。

1.2.5.3 DPPH·自由基清除效果的測(cè)定 將不同濃度的山楂粗多糖溶液和VC溶液(陽(yáng)性對(duì)照)各2 mL與0.15 mmol/L 的DPPH自由基溶液(無水乙醇配制,2 mL,混勻避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)吸光度值(Ai);將不同濃度的山楂粗多糖溶液和VC溶液各2 mL與2 mL去離子水混勻后,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光值(Ab);2 mL去離子水與2 mL DPPH·溶液混勻后,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光值(Ac),重復(fù)三次[15]。按照以下方程計(jì)算DPPH·自由基清除率。

清除率(%)=[1-(Ai-Ab)/Ac]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)值均為3次以上測(cè)定值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析,p<0.01為差異極顯著,p<0.05為差異顯著,p>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取功率對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 微波功率對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響如圖1所示。由圖1可知,當(dāng)微波功率由300 W上升到500 W時(shí),山楂多糖提取物提取量隨之增加,在500 W時(shí)達(dá)到最大值(118.63±0.46) mg/g,600 W后含量變化趨于平緩。主要原因是隨著微波功率的增加,產(chǎn)生的熱效應(yīng)增加,提高山楂多糖的分子動(dòng)能,使山楂多糖釋放并溶于溶劑中;當(dāng)功率大于500 W時(shí),山楂多糖提取物的提取量下降,可能是瞬間溫度上升,使部分多糖降解,導(dǎo)致提取量降低。因此,選取500 W為最佳微波功率。

圖1 提取功率對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響Fig.1 Effect of extraction power on extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 提取時(shí)間對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響如圖2所示。由圖2可知,山楂多糖提取量隨著提取時(shí)間的增加先增加后降低,在6 min時(shí)達(dá)到最大值(136.50±0.07) mg/g。這是因?yàn)槲⒉〞r(shí)間較短時(shí),山楂多糖析出不充分,提取率降低;但時(shí)間過長(zhǎng),在微波的作用下部分山楂多糖結(jié)構(gòu)被破壞,從而對(duì)提取量造成影響。因此,最佳的提取時(shí)間為6 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.3 提取溫度對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響 提取溫度對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響如圖3所示。由圖3可知,隨著提取溫度的增加,山楂多糖提取物提取量先增加后減小,在60 ℃達(dá)到最大值(117.94±0.09) mg/g,之后便開始下降。這可能是因?yàn)樵跍囟冗^高的情況下,其他物質(zhì)溶出,增加了溶液的粘稠度,阻礙了多糖的溶出,從而降低了提取量。因此,選取60 ℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.4 固液比對(duì)山楂多糖提取物提取量提取的影響 固液比對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響如圖4所示。由圖4可知,山楂多糖提取物提取量隨著固液比的下降先上升后下降再小幅度上升。隨著固液比的下降,溶液的黏度下降,有利于多糖的擴(kuò)散和溶出;當(dāng)固液比為1∶30 (g/mL)時(shí),山楂多糖提取物提取量最高。因固液比對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響相較于其他三個(gè)因素影響較弱,故不作為響應(yīng)因子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。綜上實(shí)際情況等因素,選擇固液比為1∶30 (g/mL)。

圖4 固液比對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化山楂多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以山楂多糖提取物提取量為試驗(yàn)指標(biāo),根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平分析實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析 通過Design-Expert 8.05b響應(yīng)面分析軟件分析,方差分析如表3所示。得到山楂多糖提取物提取量(Y),提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、提取功率(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=143.65+14.44A+11.75B-2.46C+3.15AB-7.03AC+5.58BC-22.81A2-18.17B2-24.34C2。F檢驗(yàn)顯示,模型具有很高的F值和極低的p值(p<0.01),說明模型高度顯著。失擬項(xiàng)為0.3279,沒有達(dá)到顯著水平,表明所建立的回歸模型可以用來分析該工藝條件。在一次項(xiàng)中的A、B以及二次項(xiàng)中的A2、B2、C2、AC、BC對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),一次項(xiàng)中的C以及二次項(xiàng)中的AB達(dá)到顯著水平(p<0.05),這表明這3個(gè)因素與山楂多糖提取物提取量有直接的關(guān)系,是影響提取率的主要因子。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 交互作用分析 響應(yīng)面圖形是控制其中一個(gè)因素在0水平,響應(yīng)值對(duì)應(yīng)其余兩個(gè)因素所做的三維曲面圖和等高線圖,其可以直觀地反映出各因素及其兩兩之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[16-17]。由圖5(a)可以看出,提取時(shí)間和提取溫度具有明顯的交互作用,響應(yīng)面坡度都比較陡峭,說明響應(yīng)值受提取時(shí)間和提取溫度的影響均較大。當(dāng)提取功率一定時(shí),山楂多糖提取物提取量隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)而增大,達(dá)到最大值后變?yōu)橄陆?而溫度對(duì)響應(yīng)值的影響也與其相類似;圖5(b)顯示,提取功率與提取時(shí)間也具有明顯的交互作用,固定提取溫度不變,隨著提取功率的增大,山楂多糖提取物提取量先升高后降低,微波功率在300～500 W的區(qū)間內(nèi)提取量上升較快,提取時(shí)間對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響也呈現(xiàn)此規(guī)律;圖5(c)顯示,提取功率與提取溫度之間具有明顯的交互作用,當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí),山楂多糖提取物提取量隨著提取功率的增大而增多,達(dá)到最大值后隨即降低,提取溫度對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響也與之相類似。

圖5 各因素交互作用對(duì)山楂多糖提取物提取量的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on the yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.2.4 最佳工藝條件確定與驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.05b軟件分析,山楂多糖提取物提取的最佳條件是功率493.81 W,提取時(shí)間7.03 min,提取溫度63.49 ℃。在最佳提取條件下預(yù)測(cè)山楂多糖提取物提取量的最大值為148.28 mg/g。綜合考慮實(shí)際,確定最后修正的最佳工藝條件為:功率500 W,提取時(shí)間7 min,提取溫度63 ℃,在修正條件下驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果顯示山楂多糖提取物提取量為(147.10±0.32) mg/g,與模型預(yù)期值差異不顯著。說明該優(yōu)化結(jié)果可靠,可以用于山楂多糖的提取工藝。

通過上述最優(yōu)條件得到的山楂多糖提取物,其中多糖含量達(dá)39.32%±0.80%。

2.3 山楂粗多糖降血糖、降血脂活性測(cè)定

2.3.1 山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率 山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,α-葡萄糖苷酶抑制率呈逐漸上升趨勢(shì),經(jīng)測(cè)定山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為(99.22±0.89) μg/mL。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)得其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為0.16 μg/mL?？梢娚介侄嗵菍?duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制作用,說明山楂粗多糖具有降血糖的功效。

圖6 不同濃度山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations on α-glucosidase

2.3.2 山楂粗多糖對(duì)胰脂肪酶抑制率 山楂粗多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制率結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,胰脂肪酶抑制率呈逐漸上升趨勢(shì),經(jīng)測(cè)定山楂粗多糖對(duì)胰脂肪酶抑制率的IC50值為(22.50±0.79) mg/mL。以?shī)W利司他為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)得其對(duì)胰脂肪抑制率的IC50值為0.91 mg/mL。說明山楂粗多糖具有較好的降血脂作用。

圖7 不同濃度山楂粗多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations on pancreatic lipase

2.3.3 山楂粗多糖對(duì)DPPH·的清除能力 山楂粗多糖對(duì)DPPH·的清除能力結(jié)果如表5所示。由表5可以看出,在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,DPPH·清除率呈上升趨勢(shì),經(jīng)測(cè)定山楂粗多糖對(duì)DPPH·清除率的IC50值為(185.80±0.64) μg/mL。以VC陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)得其對(duì)DPPH·清除率的IC50值為8.81 μg/mL。說明山楂粗多糖具有較好的抗氧化作用,山楂粗多糖是山楂具有良好抗氧化功能的主要物質(zhì)。在正常情況下體內(nèi)含有一定的自由基,當(dāng)體內(nèi)的自由基超過一定額度以后對(duì)人體造成一定的傷害,引起一系列慢性疾病,如高血糖、高血脂,故測(cè)定DPPH自由基清除率對(duì)山楂粗多糖降血糖、降血脂的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

圖8 不同濃度山楂粗多糖對(duì)DPPH·清除率Fig.8 DPPH· scavenging rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法對(duì)微波提取山楂提取物進(jìn)行工藝優(yōu)化,得到其最佳工藝條件為:提取溫度63 ℃,微波功率500 W,提取時(shí)間7 min,在此條件下山楂多糖提取量為(147.10±0.32) mg/g。山楂粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶具有較好的抑制作用,對(duì)DPPH·具有良好的清除能力,其IC50分別為(99.22±0.89)、(22.50±0.79)、(185.80±0.64) μg/mL,說明山楂粗多糖中具有降血糖、降血脂的活性成分,為山楂的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。