楊 玲,劉 齊,劉成浩,楊抒楠,韓蕭茜,趙一芃,杜 勇

(北京市藥品檢驗(yàn)所,北京 102206)

蜂膠為蜜蜂科昆蟲意大利蜂(ApismelliferaL.)工蜂采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物。能夠用于解毒消腫、收斂生肌、體虛早衰、高脂血癥等[1]。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)查詢結(jié)果,截止到2018年9月30日,國產(chǎn)和進(jìn)口保健食品中以蜂膠為原料的共有1459種,主要功效為提高免疫力、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂等。酚酸及其脂類是蜂膠的主要活性成分之一[2],阿魏酸可抗氧化、清除自由基、抗血栓、抗菌抗病毒、抑制腫瘤、降血脂、防治冠心病、保護(hù)DNA抗氧化活性等[3]。異阿魏酸和阿魏酸的功效相似,具有明顯的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用,可以抑制多種炎癥,而且毒性小,對(duì)胃腸道無刺激[4]。咖啡酸可以治療化療引起的白細(xì)胞下降,提高機(jī)體免疫機(jī)能,預(yù)防感染[5]?？Х人岜揭阴ゾ哂幸种瓢┘?xì)胞、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[6],均與其保健功效相符,可作為質(zhì)控指標(biāo)。

中國藥典2015年版已經(jīng)采用高效液相色譜法測(cè)定蜂膠中白楊素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和喬松素[1]。近年也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用UPLC、HPLC的方法同時(shí)測(cè)定蜂膠中多種黃酮及酚酸的含量[7-9]。但絕大多數(shù)以蜂膠為原料的保健食品都是采用測(cè)定總黃酮的含量作為質(zhì)控方法,此類方法專屬性差,精確度低,難以準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品質(zhì)量,同時(shí)增加了造假、使用替代原料的潛在風(fēng)險(xiǎn)。蜂膠中化學(xué)成分與有效成分的多樣性、復(fù)雜性,使得測(cè)定單一的功效或指標(biāo)性成分難以準(zhǔn)確表達(dá)產(chǎn)品質(zhì)量,只有盡可能對(duì)其中的多種有效成分或主要成分進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià),才能達(dá)到全面控制質(zhì)量的目的。但是對(duì)照品供需矛盾和多指標(biāo)質(zhì)控高昂的檢測(cè)成本反過來又限制了此種質(zhì)量控制模式在實(shí)際生產(chǎn)、科研、監(jiān)督中的應(yīng)用。

一測(cè)多評(píng)法通常以一個(gè)對(duì)照品為參照物,建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子,并通過它計(jì)算其他成分的含量,實(shí)現(xiàn)多成分的同時(shí)測(cè)定。該方法可以減少對(duì)照品的使用數(shù)量,降低檢測(cè)成本,節(jié)約檢測(cè)時(shí)間,在中藥材、中成藥及食品的質(zhì)量評(píng)價(jià)中得到了應(yīng)用[10-18],而以蜂膠為原料的保健食品數(shù)量眾多,有必要建立一個(gè)科學(xué)、高效的質(zhì)量控制方法。本研究參考文獻(xiàn)[19-20]的技術(shù)要求,以期建立以異阿魏酸為參照物,HPLC法測(cè)定以蜂膠為單一原料的保健食品中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸及咖啡酸苯乙酯的“一測(cè)多評(píng)”檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡酸(批號(hào):110885-201703)、阿魏酸(批號(hào):110773-201614)、異阿魏酸(批號(hào):111698-201103)及咖啡酸苯乙酯(批號(hào):112024-201601) 均由中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇為色譜純 默克股份兩合公司;磷酸 色譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水 自制重蒸餾水;測(cè)定用樣品 市售蜂膠類保健食品,均為蜂膠軟膠囊。

島津LC-20AD高效液相色譜儀(方法學(xué)考察所用) 日本島津制作所;Waters e2695高效液相色譜儀 沃特世公司;Aglient-1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;XS-205電子分析天平 梅特勒-托利多集團(tuán);SB-25-12D超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸及咖啡酸苯乙酯對(duì)照品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為15.09、10.00、20.02、60.72 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品提取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 提取溶劑的選擇 參考文獻(xiàn)提取方法[7-8],取編號(hào)001的蜂膠軟膠囊樣品內(nèi)容物,混勻,精密稱取0.5 g,分別以乙醇、75%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、水為提取溶劑,超聲處理30 min,分別進(jìn)樣,以峰面積為縱坐標(biāo),提取溶劑為橫坐標(biāo),制作柱形圖,比較最優(yōu)提取結(jié)果,確定提取溶劑。

1.2.2.2 提取時(shí)間的選擇 確定提取溶劑后,采用最優(yōu)提取溶劑進(jìn)行提取,考察15、30、45 min 3種提取時(shí)間對(duì)峰面積的影響,分別進(jìn)樣,以峰面積為縱坐標(biāo),提取時(shí)間為橫坐標(biāo),制作柱形圖,確定最佳提取時(shí)間。

1.2.3 供試品溶液制備 取蜂膠軟膠囊內(nèi)容物,混勻,精密稱取0.5 g,置于50 mL容量瓶中,加70%甲醇適量溶解,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz),冷卻后用70%甲醇定容至刻度,搖勻。以0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:資生堂UG120(方法學(xué)考察所用),Kromasil 100-5-C18,Aglient ZORBAX SB-C18,規(guī)格皆為柱長(zhǎng)250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm;流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(洗脫程序見表1);檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;柱溫30 ℃;流速為:1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。

1.2.5.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算 本研究采用以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得的fsi取平均值作為定量用fsi。計(jì)算公式為:fsi=(As×Ci)/(Ai×Cs),公式中fsi為相對(duì)校正因子,As為參照物對(duì)照品s峰面積,Cs為參照物對(duì)照品s濃度,Ai為待測(cè)成分對(duì)照品i峰面積,Ci為待測(cè)成分對(duì)照品i濃度。

1.2.5.3 相對(duì)保留時(shí)間的確定 取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣,記錄4種成分的保留時(shí)間,并分別計(jì)算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)保留時(shí)間。計(jì)算公式:ras=tRa/tRs,tRa為待測(cè)成分的保留時(shí)間,tRs為內(nèi)參物的保留時(shí)間,ras為二者的比值即相對(duì)保留時(shí)間。

1.2.5.4 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各成分色譜峰峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為001的樣品,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、4、8、12、24 h注入液相色譜儀,記錄各成分峰面積,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為001的樣品,按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算咖啡酸等4種成分的含量,并計(jì)算RSD值。

1.2.5.7 回收率試驗(yàn) 取編號(hào)為001的樣品,精密稱定9份,每份0.25 g,分成3組,每組3份,分別精確添加含咖啡酸1.119 mg/mL的對(duì)照品溶液0.15、0.30、0.45 mL,含阿魏酸0.1123 mg/mL的對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.2 mL,含異阿魏酸1.008 mg/mL的對(duì)照品溶液0.15、0.30、0.45 mL,含咖啡酸苯乙酯1.033 mg/mL的對(duì)照品溶液1.0、3.0、4.0 mL,按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并測(cè)定,分別計(jì)算回收率。

1.2.5.8 系統(tǒng)耐用性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算以異阿魏酸為參照物的其余3種成分相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間。分別采用3臺(tái)不同品牌的高效液相色譜儀(其余2臺(tái)為Waters e2695高效液相色譜儀;Aglient-1100高效液相色譜儀),3根不同型號(hào)的色譜柱(其余2根為Kromasil 100-5-C18,Aglient ZORBAX SB-C18),及在同一臺(tái)高效液相色譜儀(島津LC-20AD高效液相色譜儀)上選擇3種不同的柱溫和3種不同的流速進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果比較 取以蜂膠為單一原料的保健食品6批,按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定,并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算咖啡酸等4種成分的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品及樣品的色譜圖

對(duì)照品及樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。圖1中可以看出,峰1～4分別為咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯,4種成分能夠明顯分離開來。

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖(A),供試品HPLC色譜圖(B)Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B)注:1.咖啡酸;2.阿魏酸;3.異阿魏酸;4.咖啡酸苯乙酯。

2.2 提取方法的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 提取溶劑的選擇 圖2為提取溶劑對(duì)4種成分峰面積的影響結(jié)果。從圖2中可以看出,以70%甲醇為提取溶劑時(shí),各成分峰面積均為最大值,故選擇70%甲醇為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對(duì)4種成分峰面積的影響Fig.2 Effect of different extracting solvents on peak area of four components

2.2.2 提取時(shí)間的選擇 圖3為提取時(shí)間對(duì)4種成分峰面積的影響。從圖3中可以看出,咖啡酸、阿魏酸的峰面積隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化,異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯在超聲提取30 min時(shí),峰面積最高,超聲時(shí)間增加至45 min時(shí),峰面積比30 min時(shí)略低。綜上選擇30 min為超聲提取最佳時(shí)間。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)4種成分峰面積的影響Fig.3 Effect of different extracting time on peak area of four components

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系 按“1.2.5.1”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯在0.5030～25.15、0.1000～20.00、0.5005～80.08、2.024～202.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均為0.9999,結(jié)果見表2。

表2 4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Stand curve of four components

2.3.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算 本研究中以異阿魏酸為參照物,根據(jù)不同進(jìn)樣量分別計(jì)算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)校正因子,并求平均值作為最終結(jié)果,結(jié)果見表3。由表3可知,咖啡酸3種成分的相對(duì)校正因子分別為0.9503、0.9276、1.3902。

表3 咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)校正因子Table 3 Relative correcting factors of caffeic acid,ferulic acid and phenethyl caffeate

2.3.3 相對(duì)保留時(shí)間的確定 色譜峰的準(zhǔn)確定位是保證QAMS法應(yīng)用的前提。本研究中,咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定,對(duì)照品來源有保證,作為參照物均可滿足方法的要求,進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間考察時(shí)發(fā)現(xiàn),異阿魏酸為第3個(gè)出峰,保留時(shí)間相對(duì)居中,以此為參照物計(jì)算其余3種成分的相對(duì)保留時(shí)間的誤差較小,故選擇其為參照物。本研究以異阿魏酸為參照物,分別計(jì)算咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)保留時(shí)間,咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.594、0.914、2.670,可作為試驗(yàn)中3種成分的定位依據(jù),見表4。

表4 4種成分相對(duì)保留時(shí)間Table 4 Relative retention time of 4 components

2.3.4 精密度試驗(yàn) 按“1.2.5.4”項(xiàng)下進(jìn)行精密度試驗(yàn),結(jié)果見表5。由表5可知,咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯峰面積的RSD分別為0.1%、0.1%、0.1%、0.1%,表明儀器精密度良好。

表5 4種成分精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision test of 4 components

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2.5.5”項(xiàng)下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果見表6。由表6可知,咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯峰面積的RSD分別為1.2%、0.9%、0.8%、1.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 4種成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of the stability of 4 components

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.2.5.6”項(xiàng)下進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸苯乙酯含量測(cè)定結(jié)果見表7。由表7可知,RSD分別為1.3%、2.0%、1.1%、0.9%,表明該方法重復(fù)性良好。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of reproducibility test

2.3.7 回收率試驗(yàn) 按“1.2.5.7”項(xiàng)下進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果見表8。由表8可知,咖啡酸等4種成分的平均加標(biāo)回收率在99.85%～101.69%之間,RSD為1.7%～2.3%,表明各成分回收率良好。

表8 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 8 Results of recovery test

續(xù)表

2.3.8 系統(tǒng)耐用性考察 按“1.2.5.8”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn),更換儀器和色譜柱后,相對(duì)校正因子結(jié)果見表9～表13。由表9～表13可知,相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD為1.1%～3.5%,表明該方法可適用于不同的色譜系統(tǒng)及不同的色譜柱。另在同一色譜系統(tǒng)中采用不同的流速和柱溫進(jìn)行試驗(yàn),相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好,RSD為0.4%～1.1%,表明該方法可適用于不同的試驗(yàn)環(huán)境。另外,更換不同的色譜柱后,考察3種成分的相對(duì)保留時(shí)間,RSD為0.5%～2.8%,表明使用不同的色譜柱,相對(duì)保留時(shí)間變化幅度較小,可準(zhǔn)確定位。

表9 不同色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子Table 9 Relative correcting factors determined by different columns

表10 不同儀器測(cè)得相對(duì)校正因子Table 10 Relative correcting factors determined by different instruments

表11 不同流速測(cè)得相對(duì)校正因子Table 11 Relative correcting factors determined by different velocity

表12 不同柱溫測(cè)得相對(duì)校正因子Table 12 Relative correcting factors determined by column temperature

表13 不同色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間Table 13 Relative retention times determined by different columns

2.4 一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法的樣品測(cè)定結(jié)果比較

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算6批樣品中咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的含量,結(jié)果見表14。標(biāo)準(zhǔn)曲線法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果相對(duì)平均偏差(RAD)在0.1%～1.7%之間,表明其測(cè)定結(jié)果基本一致。

表14 樣品測(cè)定結(jié)果Table 14 Results of sample determination

3 結(jié)論

本研究建立了以蜂膠為單一原料的保健食品中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸及咖啡酸苯乙酯的一測(cè)多評(píng)檢測(cè)方法,以異阿魏酸為參照物,進(jìn)行一測(cè)多評(píng),并且對(duì)比了一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明,蜂膠中4種成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r>0.9999,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD在0.1～2.0%之間,加標(biāo)回收率在99.85%～101.69%,RSD為1.7%～2.3%,咖啡酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙酯的相對(duì)校正因子分別為0.9503、0.9276、1.3902,相對(duì)保留時(shí)間分別為0.594、0.914、2.670,且在不同實(shí)驗(yàn)條件下重現(xiàn)性良好,一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值與標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)測(cè)值相對(duì)平均偏差在0.1%～1.7%之間,測(cè)定結(jié)果基本一致,可以實(shí)現(xiàn)以異阿魏酸為參照物,對(duì)蜂膠中4種成分的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。