胡 珀,金 華

(淮安市食品藥品檢驗(yàn)所,江蘇淮安 223001)

大豆異黃酮是大豆中的一類次生代謝產(chǎn)物,屬黃酮類中的異黃酮多酚化合物[1]。目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種,包括游離型苷元和相應(yīng)糖苷[2]。大豆異黃酮是天然的優(yōu)質(zhì)抗氧化劑,具有很強(qiáng)的清除羥自由基(-OH)的能力;具有防癌抗腫瘤、降低膽固醇、預(yù)防骨質(zhì)疏松和心血管疾病、延緩衰老、改善婦女更年期綜合癥等多種生理功能[3-6]。因此,以大豆異黃酮為主要活性成分的保健食品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。其中大豆苷(Daidzin)、大豆黃苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆素(Daidzein)、大豆黃素(Glycitein)以及染料木素(Genistein)六種大豆異黃酮單體是大豆中異黃酮的主要組分。

目前,保健食品市場(chǎng)存在生產(chǎn)低水平重復(fù)、價(jià)位較高、夸大產(chǎn)品功效的現(xiàn)象。因此,應(yīng)該提高保健食品功效成分的檢測(cè)分析水平[7]。保健食品中大豆異黃酮含量的傳統(tǒng)測(cè)定方法有紫外分光光度法(UV)，該法具有方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但特異性較差,無(wú)法判斷樣品中各組分的構(gòu)成情況[8];薄層掃描法(TLCS),該法具有取樣量少、分離效果好等優(yōu)點(diǎn),能較好地進(jìn)行定性分析,但定量檢測(cè)精度不高,人為誤差較大[9];氣相色譜法(GC)法具有進(jìn)樣量少、特異性高等優(yōu)點(diǎn),但在測(cè)定時(shí)需制備衍生物,步驟較多,耗時(shí)長(zhǎng),從而限制了該法的推廣應(yīng)用[8];酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn),多用于生物體血液及尿樣中大豆異黃酮的檢測(cè)[10];高效液相色譜法(HPLC)主要是參照GB/T 23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法高效液相色譜法》[11],該分析方法具有自動(dòng)化程度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但儀器運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng),需要60 min,不適合研發(fā)檢測(cè),另外,待檢樣品基質(zhì)復(fù)雜,大豆異黃酮含量低,不易檢出,長(zhǎng)期直接進(jìn)樣,易污染色譜柱。

本課題采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法對(duì)保健食品中的大豆異黃酮進(jìn)行檢測(cè),采用固相萃取技術(shù),去除了油性基質(zhì)干擾;采用超高效液相色譜分離技術(shù),增加分析的通量,縮短了分析時(shí)間,同時(shí)減少溶劑用量,降低分析成本[12];通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè),實(shí)現(xiàn)高靈敏度,檢出濃度達(dá)到納克數(shù)量級(jí)。研究結(jié)果表明,此種方法樣品前處理簡(jiǎn)單、有機(jī)試劑消耗少、時(shí)間短,能夠滿足大豆異黃酮定性和定量檢測(cè)需求,為保健食品的質(zhì)量評(píng)價(jià)及研究提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆磷脂軟膠囊 湯臣倍健股份有限公司,批號(hào)20180401G;倍仕好牌大豆異黃酮軟膠囊 浙江康恩貝健康科技有限公司 批號(hào)R1810021;百合康牌大豆卵磷脂軟膠囊 威海百合生物技術(shù)股份有限公司 批號(hào)412688012;大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素(純度均≥90%) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜級(jí)) 德國(guó)Merker公司;甲酸(色譜級(jí)) 德國(guó)CNW公司;CNWBOND Si、CNWBOND Florisil、CNWBOND HC-C18、CNWBOND LC-C18、Poly-Sery MCX固相萃取柱 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水機(jī)制得。

XS205DU電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;API 4000+三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB公司;H-CLASS超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;2695/2998高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;KH-100B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;X1R型高速低溫離心機(jī) 美國(guó)ThermoFisher公司;Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 取20粒軟膠囊樣品,傾出內(nèi)容物,用干凈玻璃棒攪拌均勻,現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制 分別稱取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g于100 mL容量瓶中,以甲醇定容至刻度,得100 μg/mL大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素單標(biāo)儲(chǔ)備溶液,4 ℃避光保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制 分別移取1 mL大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素單標(biāo)儲(chǔ)備溶液于同一100 mL容量瓶中,用甲醇定容得濃度為1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。分別移取0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量。

1.2.4 樣品處理 稱取0.5 g樣品置于50 mL容量瓶中,加80%甲醇溶液至接近刻度,超聲提取20 min,用80%甲醇溶液定容,搖勻。取樣品溶液置于離心管中,8000 r/min離心10 min。取上清液1 mL全部通過(guò)CNWBOND Florisil固相萃取柱(預(yù)先以5 mL甲醇,5 mL水活化),以5 mL水淋洗柱體,25 MPa加壓抽干5 min。以6 mL甲醇洗脫柱體,于40 ℃氮?dú)獯蹈?以1 mL 80%甲醇溶液溶解,過(guò)0.22 μm微孔濾膜后待測(cè)定。

1.2.5 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;梯度洗脫程序?yàn)?88% A 0～4.0 min;88%～80% A 4.0～6.0 min;80% A 6.0～8.0 min;80%～70% A 8.0～10.0 min;70%～20% A 10.0～10.1 min;20% A 10.1～12 min,流速0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜離子源為ESI(+),霧化電壓:5500 V;離子傳輸溫度:500 ℃,各大豆異黃酮多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式監(jiān)測(cè)參數(shù),見(jiàn)表1。

1.2.6 定性、定量檢測(cè)

1.2.6.1 定性檢測(cè) 取1.2.3 中50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和1.2.4中樣品溶液按色譜條件1.2.5進(jìn)行測(cè)定,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間,對(duì)樣品溶液中的組分進(jìn)行定性,保留時(shí)間應(yīng)一致。

1.2.6.2 定量檢測(cè) 將1.2.3中大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液在色譜條件1.2.5下進(jìn)行測(cè)定,繪制以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.2.4制備的樣品溶液注入液質(zhì)聯(lián)用儀中,保證樣品溶液中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素的響應(yīng)值均在工作曲線的線性范圍內(nèi),若超出最高濃度,將樣品稀釋后再進(jìn)樣。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

樣品未經(jīng)過(guò)除油處理,會(huì)殘留較多油溶性雜質(zhì),如亞油酸、油酸等,特別是批量進(jìn)樣后,色譜柱受污染更重,致使系統(tǒng)壓力明顯升高,很容易超過(guò)警戒最高壓力[13]。

通過(guò)固相萃取能夠去除大豆苷之前的大部分雜峰,很好地降低了樣液對(duì)液相色譜柱的污染損耗,延長(zhǎng)了色譜柱的使用時(shí)間[14]。實(shí)驗(yàn)考察了5種不同填料的固相萃取柱,測(cè)定樣品在添加1 mL 50 μg/L大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的回收率。表2結(jié)果表明Florisil固相萃取柱有較好的回收率和凈化效果,大豆異黃酮中各組分回收率最高,平均回收率為85.4%,并具有污染小、可處理小體積試樣等優(yōu)點(diǎn),能夠在保留目標(biāo)化合物的同時(shí),除去油性樣品中的干擾物,可用于大豆異黃酮分離純化。Florisil 固相萃取柱中的萃取介質(zhì)弗羅里硅土作為氧化鎂復(fù)合的極佳硅膠吸附劑,適合于從非極性基質(zhì)中吸附極性化合物,具有高吸附容量、高靈敏度、方便耐用和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[15]。

表2 不同固相萃取柱(SPE)的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results on recovery of different solid phase extraction columns(SPE)

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

大豆異黃酮各組分在質(zhì)譜上具有很強(qiáng)的正離子響應(yīng),因此選擇正離子模式進(jìn)行掃描。500 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣分析,在正離子模式下,6種大豆異黃酮各組分一級(jí)質(zhì)譜均出現(xiàn)[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,且豐度較大,因此選擇分子離子峰作為母離子。分別對(duì)6中大豆異黃酮各組分母離子進(jìn)行轟擊碎裂,得到特征碎片離子峰信息,確定各目標(biāo)物的特征子離子,具體見(jiàn)表1。在MRM模式下優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓,確定最佳質(zhì)譜檢測(cè)條件。

表1 6種大豆異黃酮質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 6 soybean isoflavones

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱的選擇 以C18色譜柱作為分析柱。通過(guò)系列實(shí)驗(yàn),比較了Waters ACQUITY UPLC C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)三種色譜柱對(duì)6種大豆異黃酮各組分的分離效果。結(jié)果表明,在相同色譜條件下Waters ACQUITY UPLC C18柱對(duì)異黃酮的分離效果最好,能提供良好的峰形,因此選擇該色譜柱作為分析柱。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 考察了不同流動(dòng)相對(duì)異黃酮色譜行為的影響。以含乙腈-水、甲醇-水作流動(dòng)相,在采取梯度洗脫的方式時(shí),大豆苷和大豆黃苷沒(méi)有完全分離開(kāi);采用0.5%的乙酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相,大豆素和大豆黃素沒(méi)有完全分離開(kāi);采用20 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈作為流動(dòng)相,大豆黃素與染料木素色譜峰重合;以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相,通過(guò)優(yōu)化兩相的配比,6種異黃酮均可獲得滿意的分離度。通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件,獲得了6個(gè)目標(biāo)物合適的保留時(shí)間和峰形,6種大豆異黃酮總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 6種大豆異黃酮總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 6 kinds of soybean isoflavones注:1:大豆苷;2:大豆黃苷;3:染料木苷; 4:大豆素;5:大豆黃素;6:染料木素。

2.4 方法的線性關(guān)系與檢出限

分別將1.2.3的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以6種大豆異黃酮各組分的色譜峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)做線性回歸,結(jié)果顯示大豆苷、染料木苷、大豆素以及染料木素在10～500 μg/L范圍內(nèi),大豆黃苷在5～500 μg/L范圍內(nèi)、大豆黃素在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好(r>0.99),見(jiàn)表3。以3倍的信噪比確定方法的檢出限,大豆黃苷、大豆黃素檢出限均為10 μg/kg,定量限均為30 μg/kg,大豆苷、染料木苷檢出限均為20 μg/kg,定量限均為60 μg/kg,大豆素、染料木素檢出限均為 30 μg/kg,定量限均為90 μg/kg。

表3 6種大豆異黃酮各組分的線性關(guān)系與檢出限Table 3 Linear relationship and detection limit for 6 soybean isoflavones

2.5 方法的回收率和精密度考察

在上述優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下,分別對(duì)樣品添加2、5和10 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行測(cè)定,平均回收率和精密度見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,加標(biāo)回收率為81.8%～98.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.7%,能夠滿足檢測(cè)方法的要求。

表4 樣品中6種大豆異黃酮各組分的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 4 Results of recovery and repeatability for 6 soybean isoflavones(n=6)

2.6 實(shí)際樣品中6種大豆異黃酮各組分檢測(cè)

取湯臣倍健大豆磷脂軟膠囊、倍仕好牌大豆異黃酮軟膠囊、百合康牌大豆卵磷脂軟膠囊,按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23788-2009[11]和本文方法進(jìn)行檢測(cè),樣品中大豆異黃酮含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23788-2009方法檢出限為5 mg/kg,樣品中的大豆苷、大豆黃素若含量低于5 mg/kg,則未檢出,而且在進(jìn)樣過(guò)程中,系統(tǒng)壓力過(guò)大,兩次報(bào)錯(cuò),說(shuō)明前處理方法不合理,未經(jīng)去油處理直接進(jìn)樣會(huì)堵塞色譜柱,而超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢出限為10～30 μg/kg,低含量的物質(zhì)也可以精確定量,通過(guò)Florisil固相萃取柱凈化,去除了油性基質(zhì)干擾,整個(gè)進(jìn)樣過(guò)程中,系統(tǒng)壓力穩(wěn)定。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果偏差在2.2%～8.3%,結(jié)果可信。

表5 樣品中大豆異黃酮含量的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of soybean isoflavones contents in the samples

3 結(jié)論

建立了保健食品中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)方法。結(jié)果表明,大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素以及染料木素在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;大豆黃苷、大豆黃素檢出限均為10 μg/kg;大豆苷、染料木苷檢出限均為20 μg/kg;大豆素、染料木素檢出限均為30 μg/kg,加標(biāo)回收率為81.8%～98.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.7%。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23788-2009液相方法結(jié)果比較,該方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限,在實(shí)際檢測(cè)工作中具有良好應(yīng)用價(jià)值。