張 艷,聶青玉,*,王圣開,付 勛

(1.重慶三峽職業(yè)學院,重慶 404155; 2.重慶市萬州食品藥品檢驗所,重慶 404155)

茶樹一般生長于溫暖濕潤的氣候環(huán)境,容易發(fā)生病蟲害。目前,茶樹蟲害超過800種，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的茶樹病害超過130種[1]。茶樹使用農藥已經(jīng)超過80種,常見農藥為有機磷類、有機氯類農藥[2]。隨著病蟲害耐藥性增加,使用農藥劑量、種類日益增多,茶葉中農藥殘留已經(jīng)嚴重影響了茶產品的質量安全。目前,茶葉農藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法等[3-7]。由于茶葉中含有多種有機酸、咖啡堿、游離糖、兒茶素、色素、鋅、硒、錳等微量物質[8],這些成分在農殘測定中,常會產生基質效應,即對于相同濃度的農藥,其在基質溶液中的色譜響應會比其在純溶劑中的響應高,從而影響待測農藥組分定量的準確性[9-10],因此研究茶基質對農殘測定的影響很有必要。

近年來,有關茶葉農藥殘留的分析研究主要集中在檢測色譜條件的優(yōu)化、樣品前處理、茶葉茶湯中農藥殘留的測定等方面[11-15],而茶基質對GC-NPD(氣相色譜-氮磷檢測器)法定量分析有機磷農藥的影響報道較少。考慮到茶葉是沖泡后飲用茶湯,所以溶出到茶湯中的殘留農藥及其它有害物質也可能會影響人體健康。因此,本試驗選取茶葉、茶湯為基質,氣相色譜法分析兩種基質對敵敵畏、毒死蜱、甲基對硫磷3種農藥線性的影響;通過不同加標水平,比較添加基質標準曲線與純溶劑標準曲線兩種校正方法對測定結果準確度和精密度的影響,以期優(yōu)化氣相色譜定量分析有機磷農藥殘留的方法,提高檢測結果準確度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

移都秀芽 重慶聚緣川秀茶葉有限公司;敵敵畏、毒死蜱、甲基對硫磷農藥標準品(純度99%) 中國標準物質中心;乙腈(色譜純)、丙酮、無水硫酸鎂、氯化鈉 成都市科龍化工試劑廠;石墨化碳(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)(色譜純) 博納艾杰爾公司。

Agilent GC 7890A氣相色譜儀(帶氮磷檢測器NPD) 安捷倫科技有限公司;NVL5100B天平 奧豪斯儀器有限公司;Mixplus漩渦振蕩儀 合肥艾本森科學儀器有限公司;HR2084打漿機 珠海飛利浦家庭電器有限公司;MD-200氮吹儀 杭州佑寧儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 茶葉:新購茶葉經(jīng)粉粹后,過20目篩制成粉狀試樣。茶湯:取茶樣3 g置于茶杯中,按茶水比(質量體積比)1∶50注入沸水,加蓋計時4 min,濾出茶湯[14]。

1.2.2 樣品前處理 分別稱取茶葉5 g、茶湯10 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中,用20 mL乙腈溶液提取,旋渦混勻2 min,超聲提取10 min后過濾,濾液收集到裝有2～3 g氯化鈉的具塞量筒中,劇烈振蕩后靜置,使乙腈相和水相分層。吸取4.00 mL上清液于裝有0.1 g PSA,0.1 g GCB和0.3 g無水硫酸鎂的離心管中[15-16],渦旋2 min,于8000 r·min-1條件下離心 5 min。取 2.00 mL上清液于刻度試管中,40 ℃氮吹至近干,用丙酮定容至2.00 mL,過0.22 μm有機系濾膜上機[17]。

1.2.3 GC條件 色譜柱:19091J-413(30 m×320 μm×0.5 μm);載氣為氮氣;氮氣流速為11 mL/min,氫氣流速為3 mL/min,空氣流速為60 mL/min;隔墊吹掃流量:5 mL/min,溶劑延遲3 min;進樣口溫度:250 ℃,NPD檢測器溫度340 ℃;升溫程序:初溫80 ℃,以20 ℃/min升溫至120 ℃,保持2 min,以20 ℃/min升溫至230 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升溫至250 ℃,保持3 min;進樣方式:脈沖不分流進樣,進樣量為1.0 μL[18]。

1.2.4 標準曲線繪制 標準儲備溶液的配制:將3種農藥標準品(敵敵畏、毒死蜱、甲基對硫磷)用丙酮稀釋定容配制成3種農藥濃度均為10 μg/mL的混標儲備溶液。吸取10 μg/mL的3種農藥標準儲備溶液,丙酮稀釋成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的標準溶液,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制純溶劑標準曲線。稱取按上述樣品前處理和檢測條件下檢測確定不含上述3種農藥的茶葉5 g、茶湯10 g,按1.2.2樣品前處理方法提取、凈化、濃縮近干后,分別加入0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的3種農藥混合標準溶液2.00 mL,上機檢測,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制基質標準曲線。

1.2.5 準確度和精密度實驗 選取茶葉5 g、茶湯10 g,加入一定量10 μg/mL混合標準溶液儲備液,茶葉基質3種農藥理論加標量為0.4、0.8、2.0 mg/kg、茶湯基質3種農藥理論加標量為0.1、0.2、0.4 mg/kg,按1.2.2提取、凈化、濃縮后加入2 mL丙酮定容,上機檢測。每個加標水平做3個平行試驗,計算加標回收率及相對標準偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所用數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 有機磷農藥混標色譜圖

NPD檢測器BLOS銣珠經(jīng)過72 h老化后,輸出電壓0.68 V時,輸出值大于20,趨于穩(wěn)定?？紤]到有機磷類農藥吸附問題,換用帶玻璃毛超高惰性襯管5190-2293。3種農藥的混合標準溶液連續(xù)進樣6次。經(jīng)反復試驗,按1.2.3色譜條件進樣分析,3種農藥混標色譜圖見圖1。圖1顯示,敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱分別在6.517、11.321、12.114 min出峰,3種農藥具有較好的分離效果。 6次重復進樣3種農藥峰面積RSD為1.35%～2.58%,重現(xiàn)性好。

圖1 敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱混標色譜圖Fig.1 The mixed-label chromatogram of dichlorvos,methyl parathion and chlorpyrifos注:1:敵敵畏;2:甲基對硫磷;3:毒死蜱。

2.2 基質對標準曲線線性的影響

分別用丙酮及茶葉、茶湯基質按1.2.4方法配制純溶劑標準溶液及基質標準溶液進行測定。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,結果見圖2～圖4。如圖2～圖4所示,茶葉茶湯配制的標準曲線與純溶劑標準曲線相比,用基質配制標準溶液的響應值明顯高于同濃度的純溶劑標準溶液響應值,說明基質增強效應明顯。這是因為茶葉中含有色素、有機酸、礦物質等基質成分,基質成分對待測組分提取、凈化除雜環(huán)節(jié)造成干擾,同時在色譜分離時,基質成分與待測組分共洗脫,從而影響待測成分的檢測。采用同一種農藥基質標準曲線斜率與純溶劑標準曲線斜率之比判斷同一基質對不同農藥的基質效應影響。以茶葉為基質配制敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱得到的標準曲線斜率與不添加基質標準曲線斜率之比分別為1.25、1.18和1.06;以茶湯為基質配制敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱得到的標準曲線與不添加基質標準曲線斜率之比分別為1.11、1.08和1.03,由此得出,茶葉茶湯對3種農藥的基質效應為敵敵畏>甲基對硫磷>毒死蜱。

圖3 甲基對硫磷標準曲線Fig.3 Standard curve of parathion methyl

圖4 毒死蜱標準曲線Fig.4 Standard curve of chlorpyrifos

3種有機磷農藥在0.05～1.00 μg/mL的濃度范圍內,線性方程、決定系數(shù)、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)結果見表1(LOD、LOQ分別以最低添加水平色譜圖中3倍、10倍噪聲表示)。通過對2種基質與純溶劑標準溶液進行線性比較分析可知:3種農藥線性方程的決定系數(shù)R2均大于0.99,無明顯差異,LOD均低于0.02 mg/kg,LOQ低于0.04 mg/kg,有較高靈敏度,能夠滿足定量分析要求[20]。

表1 3種有機磷農藥在溶劑、基質中的線性方程、R2、檢出限和定量限Table 1 Linear equations,R2,LOD and LOQ of three organophosphorus pesticides in solvent and matrices

2.3 基質對回收率及精密度的影響

以茶葉、茶湯為樣品的加標回收試驗,分別按表1的基質與純溶劑標準曲線進行校正,計算加標回收率及相對標準偏差,結果見表2和表3。

表2 3種有機磷農藥基質標準曲線計算準確度和精密度結果(n=3)Table 2 Accuracy and precision calculated by matrix standard curve of three organophosphorus pesticides(n=3)

表3 3種有機磷農藥溶劑標準曲線計算準確度和精密度結果(n=3)Table 3 Accuracy and precision calculated by solvent standard curve of three organophosphorus pesticides(n=3)

由表2、表3可知,以添加基質標準曲線定量,3種農藥回收率范圍74.75%～113.20%;而以純溶劑標準曲線定量,回收率范圍為80.40%～133.80%,其中茶葉加標回收實驗中,敵敵畏、毒死蜱和甲基對硫磷理論加標量為0.4 mg/kg時,回收率分別為133.80%、123.60%、129.80%,理論加標量為0.8、2.0 mg/kg時,回收率均小于120%,由此得出,基質對低濃度農藥影響大于對高濃度農藥的影響。通過純溶劑標準曲線與添加基質標準曲線兩種定量方法比較,發(fā)現(xiàn)低濃度加標水平實驗中,基質標準曲線定量的回收率更接近100%,高濃度加標水平實驗中,純溶劑標準曲線定量得到的回收率更接近100%。這是因為基質效應的大小與分析物濃度大小有關。當農藥濃度低,由于茶葉基質成分的存在,減少色譜系統(tǒng)活性點與待測成分作用機會,使檢測信號增強。隨著待測農藥濃度增大,基質效應減小,基質增強效應反而能夠彌補氣相色譜檢測方法過程中提取不徹底、凈化、濃縮損失、膜吸附等原因造成的回收率偏低的情況。同一種農藥在同一加標水平采用純溶劑標準曲線定量的回收率均高于基質標準曲線定量的回收率,具有明顯的基質增強效應。3種農藥在茶葉、茶湯中加標,兩種定量方式得到的相對標準偏差在0.79%～6.57%之間。同一農藥在同一空白樣品同一加標水平中,兩種校正方法得出RSD略有差異,但無明顯變化規(guī)律。

3 結論

GC-NPD分析方法測定有機磷農藥,農藥分離效果較好,3種有機磷農藥6次連續(xù)進樣的峰面積RSD值1.35%～2.58%,重現(xiàn)性好?？疾椴枞~、茶湯基質對敵敵畏、甲基對硫磷和毒死蜱的線性、準確度和精密度的影響,結果表明:3種農藥在0.05～1.00 μg/mL的濃度范圍內,決定系數(shù)無明顯差異,R2均大于0.99,具較高的靈敏度;同種農藥基質配制標準溶液響應值明顯高于同濃度純溶劑標準溶液,說明基質增強效應明顯。通過純溶劑標準曲線與添加基質標準曲線兩種定量方法比較,相對標準偏差在0.79%～6.57%之間,無明顯差異;基質對低濃度加標水平實驗回收率影響較大,而高濃度加標水平實驗中,溶劑標準曲線定量得到的回收率更接近100%,準確度更高。本實驗只以移都秀芽為研究對象,對其他品種茶葉對有機磷定量分析的影響有待進一步研究。