曹 塬,劉 杰

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于嘌呤代謝紊亂、尿酸產(chǎn)生過多或排泄障礙,造成血尿酸濃度增高,尿酸鈉結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)導(dǎo)致的一種以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形為主的疾病[1]。在急性發(fā)作期,病變關(guān)節(jié)滑膜炎性細胞浸潤、表面充血水腫、組織局部壞死,并伴隨關(guān)節(jié)積液及周圍組織中炎癥因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1α(IL-1α)含量均顯著增多[2-4]。病發(fā)時主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛,常因飲酒、高嘌呤飲食等誘發(fā),是成年人常見的炎性關(guān)節(jié)疾病之一[5-6]。目前西藥對于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療主要是控制發(fā)作癥狀,但復(fù)發(fā)率高,很難阻滯疾病進程或根治,且西藥大多不良反應(yīng)大,危害患者健康[7]。有研究報道中醫(yī)藥治療痛風(fēng)具有很好的療效,且不會產(chǎn)生嚴重副反應(yīng)[8-9]。

土三七常種植于我國云南、廣東、四川、浙江、江蘇等省,因其藥食同源的特點而被大眾所知[10]。其具有補血活血、消腫散瘀的功效,有研究表明土三七有抗菌消炎、抗HIV活性[11]?；谕寥叩目寡鬃饔?對于其改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用尚未出現(xiàn)有關(guān)報道,故本研究對土三七提取物(Garcinia Extract,GE)治療尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎進行了初步探索,以期為進一步研究土三七用于防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GE(土三七提取物) 喜樂福酒業(yè)有限公司;試驗動物 180～220 g Sprague Dawley(SD)大鼠,合格證編號:SCXK(湘)2016-0002,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;輻照鼠料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司;尿酸鈉晶體 Sigma公司;氯化鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;ELISA試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;羧甲基纖維素鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

IVC獨立通氣籠設(shè)備 蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司;WH-985-C7恒溫振蕩培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司;H1850臺式高速冷凍離心機 離心機儀器有限公司;PL-DNM-9602酶標分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與造模 50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,按體重隨機平均分為5組,每組10只。分組情況:正常組、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型組、GE高劑量組(300 mg/kg)、GE中劑量組(200 mg/kg)、GE低劑量組(100 mg/kg)。首先將樣品GE溶于生理鹽水中,加入適量的羧甲基纖維素鈉配制成對應(yīng)濃度的混懸液。實驗前6 d,藥物組按1.0 mL/kg灌胃,其他組給予等量生理鹽水,每天一次。末次給藥1 h 后,將大鼠麻醉后仰臥固定,將左踝關(guān)節(jié)彎曲,用注射器自兩骨突之間進針,注入3%無菌尿酸鈉溶液100 μL,以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓起為注入標準,制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[12-13]。正常組大鼠關(guān)節(jié)注射等體積的無菌生理鹽水。

1.2.2 大鼠步態(tài)評分及關(guān)節(jié)周徑測量 分別于造模后6、8、12、24、48 h對各組大鼠步態(tài)進行評分。評分標準[14]為：0分為正常步態(tài),雙足均勻著地;1分為輕度跛行,受試下肢略有彎曲;2分為中度跛行,受試下肢剛觸及地面;3分為重度跛行,受試下肢離開地面,三足著地行走。

于造模前及造模后 6、8、12、24、48 h后分別在受試踝關(guān)節(jié)相同部位,用無彈性軟尺測量每組大鼠的踝關(guān)節(jié)周長,記錄數(shù)據(jù)。并觀察造模前后受試大鼠關(guān)節(jié)周長的變化。通過測量不同致炎時間各組大鼠踝關(guān)節(jié)周徑,計算對相應(yīng)時刻大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及藥物抑制率,計算公式如下[15]:

某時刻腫脹率(%)=致炎t時間踝關(guān)節(jié)周徑-致炎前踝關(guān)節(jié)周徑/致炎前踝關(guān)節(jié)周徑×100

式(1)

某時刻抑制率(%)=模型組t時腫脹率-給藥組t時仲脹率/模型組t時腫脹率×100

式(2)

1.2.3 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測 造模48 h后,處死大鼠取其病損關(guān)節(jié),加4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)脫水、透明、包埋、切片,進行HE染色,于顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 炎癥因子含量測定 于造模48 h處死大鼠,腹主動脈取血,靜置30 min后,3000 r/min離心20 min,取上清液分裝與EP管中,置于-80 ℃凍存。采用雙抗體夾心ELISA法檢測IL-1β、IL-1α、TNF-α含量,根據(jù)試劑盒使用說明進行實驗操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 GE對大鼠步態(tài)及關(guān)節(jié)腫脹度的影響

于造模0、6、8、12、24、48 h分別對各組大鼠進行步態(tài)分析及評分,正常組大鼠步態(tài)正常,活動自如;模型組大鼠活動明顯減少,行走時出現(xiàn)明顯跛行,食量減小,飲水次數(shù)減少,步態(tài)評分較正常組顯著升高(p<0.05)，提示造模成功,模型組大鼠在造模8～12 h期間步態(tài)評分達到最高;與模型組相比,GE低、中、高劑量組大鼠步態(tài)有明顯改善,其中GE低劑量組在造模8、12 h步態(tài)評分顯著降低(p<0.05),GE中、高劑量組在造模后直至24 h內(nèi)步態(tài)評分較模型組均顯著降低(p<0.05),48 h后GE高劑量組大鼠步態(tài)基本恢復(fù)正常,顯示藥物組對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有緩解作用,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,結(jié)果見表1。

各組大鼠均于造模后0、6、8、12、24、48 h進行踝關(guān)節(jié)周徑測定,并計算關(guān)節(jié)腫脹度,結(jié)果如表1所示。由表1可見,與造模前相比,模型組大鼠踝關(guān)節(jié)周徑均大于正常組(p<0.05),提示造模成功。模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度在造模6 h后明顯升高,并于造模12 h后達到最大值(34.7%);與模型組相比,GE中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度均低于模型組大鼠,并且GE高劑量組效果優(yōu)于GE低劑量組(p<0.05);GE低劑量組與模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度無明顯差異。GE中、高劑量組在改善大鼠急性痛風(fēng)方面均表現(xiàn)良好,隨著時間推移,GE高劑量干預(yù)療效優(yōu)于GE中劑量。

表1 GE對大鼠步態(tài)評分及關(guān)節(jié)腫脹度(%)的影響Table 1 Effect of GE on gait score and joint swelling(%)in

2.2 GE對大鼠關(guān)節(jié)腫脹抑制率的影響

根據(jù)每造模后各時間段腫脹度的計算,代入公式(2)中計算出藥物抑制率(表2所示)。

表2 GE對大鼠關(guān)節(jié)腫脹抑制率(%)的影響Table 2 Effect of GE on inhibition rate(%)of

通過與模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度相比,GE中、高劑量抑制關(guān)節(jié)腫脹效果顯著(p<0.05),其中GE高劑量抑制大鼠關(guān)節(jié)腫脹效果極顯著(p<0.01),GE中劑量組抑制率在致炎后6 h達到47.1%,隨著時間推移,GE中劑量組抑制率在8～48 h內(nèi)保持在20%以上,GE高劑量組抑制率在大鼠致炎后6～48 h內(nèi)均保持在50%以上,與GE低劑量組相比,呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

2.3 GE對大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響

對大鼠滑膜組織染色結(jié)果(圖1)顯示,正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織正常,無炎性細胞浸潤;模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜表面粗糙不平,可見大量的炎性細胞浸潤,滑膜組織周圍有密集的炎癥細胞分布;給予GE的藥物組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中炎性細胞明顯減少,且中、高劑量干預(yù)效果明顯,關(guān)節(jié)周圍軟組織充血水腫明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少。

圖1 GE對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎滑膜組織炎癥細胞浸潤的影響(HE,200×)Fig.1 Effect of GE on inflammatory cell infiltration in synovial tissue of rat gouty arthritis induced by sodium urate(HE,200×)

2.4 GE對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎部分炎癥因子的影響

GE對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎48 h后關(guān)節(jié)組織中炎癥因子IL-1α、TNF-α、IL-1β水平的影響見圖2。炎癥因子檢測結(jié)果顯示,在尿酸鈉造模成功48 h后,與模型組大鼠相比,GE中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1α、TNF-α、IL-1β含量明顯降低,與模型組相比有顯著差異(p<0.05)。

圖2 GE對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎部分炎癥因子的影響Fig.2 Effect of GE on some inflammatory factors in rat gouty arthritis induced by sodium urate注:與模型組比較:*p<0.05,**p<0.01。

3 結(jié)果與討論

機體長期嘌呤代謝異常,引起血尿酸含量升高或體外排出尿酸量減少,從而導(dǎo)致尿酸鹽在體內(nèi)沉積[16-17]。尿酸鹽能夠誘發(fā)體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生及釋放,造成炎性細胞浸潤現(xiàn)象,因此機體內(nèi)尿酸鹽沉積是建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的靶點[18-19]。炎癥因子IL-1α、IL-1β、TNF-α是炎癥反應(yīng)的直接誘導(dǎo)因素,其中IL-1β起著關(guān)鍵作用,它通過抑制關(guān)節(jié)滑膜組織中酶的表達引起關(guān)節(jié)軟骨膠原蛋白的變性或損失,引起局部關(guān)節(jié)紅腫、關(guān)節(jié)表面溫度升高、病變關(guān)節(jié)表面發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀[20-23]。根據(jù)尿酸鈉注射引起的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,能夠很好地模擬人體痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀,據(jù)此考察GE對尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的緩解作用。

研究結(jié)果表明，GE中、高劑量對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度有顯著緩解作用(p<0.05)。造模成功后,模型組大鼠注射尿酸鈉部位關(guān)節(jié)產(chǎn)生明顯腫脹,與正常組大鼠相比有顯著差異(p<0.05),在造模12 h后模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度達到最高峰34.7%,而GE中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示其與模型組大鼠相比有顯著差異(p<0.05)。GE中、高劑量對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹有較明顯的改善作用,證明GE對急性通風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有積極作用,其中GE中劑量組大鼠在造模12 h后的關(guān)節(jié)腫脹度降到25%,GE高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度則降至20%以下。步態(tài)分析及病理實驗結(jié)果顯示GE中、高劑量對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的改善作用均顯著(p<0.05);模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎癥細胞浸潤明顯,而GE中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性細胞浸潤減少。炎癥因子檢測結(jié)果顯示,GE中、高劑量大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-1α含量較模型組顯著降低(p<0.05),GE中、高劑量組能夠顯著降低痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的炎癥因子水平,從而緩解痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的癥狀。GE在大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病時表現(xiàn)出積極的影響作用,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性,本研究證實GE在抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎方面有緩解作用,但其作用機制尚不明確,有待進一步研究。