王 麟,張 巖,李 菲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院包裝與印刷工程學(xué)院,河南鄭州 450046)

隨著食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展以及消費(fèi)者對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注,人們對(duì)食品包裝提出了更高的要求。現(xiàn)在食品包裝不僅要具有功能性、新穎性和吸引力,還應(yīng)為消費(fèi)者提供有關(guān)食品質(zhì)量和安全的必要信息。在食品的整個(gè)流通過(guò)程中,除了自身影響因素外,食品的質(zhì)量和安全性與外部環(huán)境因素(如溫度、時(shí)間、濕度、光照和機(jī)械應(yīng)力等)密切相關(guān)[1]。在上述因素中,隨環(huán)境變化的儲(chǔ)存溫度是導(dǎo)致食物腐敗最不可預(yù)測(cè)的因素,極大影響了食物的保質(zhì)期。因此,監(jiān)測(cè)食物流通過(guò)程中的溫度變化至關(guān)重要[2]。作為一種智能食品包裝技術(shù),時(shí)間溫度指示劑(Time temperature indictor/integrator,TTI)可以監(jiān)控和記錄食品配送過(guò)程中一些關(guān)鍵參數(shù),結(jié)合時(shí)間和溫度的累積效應(yīng),動(dòng)態(tài)顯示食品的剩余保質(zhì)期,為食品生產(chǎn)者、運(yùn)輸者以及消費(fèi)者提供準(zhǔn)確檢測(cè)和評(píng)估食品品質(zhì)的方法[3]。

根據(jù)時(shí)間溫度指示劑反應(yīng)原理和指示方法的不同,可將其分成不同的種類,如擴(kuò)散型、聚合物型、酶型、微生物型等[4]。其中,酶型時(shí)間溫度指示劑的性能穩(wěn)定,成本低廉,且易于控制,受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)家廣泛的關(guān)注和研究[5]。酶型TTI是基于酶促反應(yīng)原理,利用酶水解底物使pH改變,導(dǎo)致pH指示劑變色;或者是酶直接催化底物,產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化,從而實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)食品質(zhì)量變化的目的[6]。根據(jù)TTI中酶的存在形態(tài),可將其分為液態(tài)酶型TTI和固態(tài)酶型TTI。目前,研究酶型TTI的專利和文章有上百多篇,但相關(guān)的總結(jié)性文章并不多,尤其是關(guān)于固態(tài)酶型TTI的綜述文章更是匱乏。基于此現(xiàn)狀,本文對(duì)酶型TTI的最新研究進(jìn)行了總結(jié),從液態(tài)酶型TTI和固態(tài)酶型TTI兩方面分析,闡述了酶型TTI的研究現(xiàn)狀、存在的主要問(wèn)題及其改進(jìn)方法,旨在為酶型TTI在食品包裝中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 液態(tài)酶型TTI

1.1 脂肪酶型

脂肪酶能逐步將甘油酯水解成甘油和脂肪酸,降低溶液的pH,使酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化,且溫度越高,水解速度越快,從而可用作指示食品質(zhì)量變化的工具。商品化的CheckPointTM(瑞典Vitsab A.B. 公司)就是脂肪酶型TTI的典型代表[7]。CheckPointTM由一個(gè)帶有兩個(gè)密封隔間的圓形塑料袋組成,一個(gè)隔室含有脂肪酶水溶液和pH指示劑,另一個(gè)隔室含有脂質(zhì)底物。激活之前,即脂肪酶和底物還未開(kāi)始反應(yīng)時(shí),酶溶液和底物可以分開(kāi)保存很長(zhǎng)時(shí)間。通過(guò)向塑料袋施加機(jī)械壓力,破壞兩隔室之間的屏障,誘導(dǎo)酶溶液和底物混合,可以激活TTI。隨著反應(yīng)程度的增加,溶液的pH逐漸降低,使pH指示劑的顏色從綠色變?yōu)槌壬?。在其范圍結(jié)束時(shí),即反應(yīng)程度達(dá)到100%時(shí),該TTI顯示出最終的紅色,呈現(xiàn)出準(zhǔn)確且容易肉眼識(shí)別的顏色變化,從而可精確預(yù)測(cè)食品的保質(zhì)期,如圖1所示。

圖1 不同反應(yīng)程度下CheckPointTM顏色變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of the color change of CheckPointTM at different reaction levels

吳丹等[8]基于脂肪酶和甘油三丁酸酯之間的反應(yīng),改變底物的濃度,開(kāi)發(fā)出了四種具有不同活化能的TTI體系,擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。四種TTI的活化能值分別為42.12、36.84、31.60和34.42 kJ/mol,且TTI達(dá)到終點(diǎn)所需的響應(yīng)時(shí)間隨著底物濃度的降低而增加,適用于監(jiān)測(cè)活化能在30～42 kJ/mol范圍內(nèi)的新鮮食品,例如由于脂質(zhì)氧化、酶促反應(yīng)等導(dǎo)致質(zhì)量損失的水果、蔬菜、魚(yú)類等食品。任興晨等[9]構(gòu)建了適用于4 ℃下使用的脂肪酶TTI,且研究了乳化劑聚乙烯醇和Na+、K+、Mg2+、Ca2+等金屬離子對(duì)TTI的影響。在聚乙烯醇乳化液和CaCl2存在下,制備的TTI最適合低溫下使用,其動(dòng)力學(xué)活化能為60.14 kJ/mol,為脂肪酶型TTI 在食品冷藏溫度下的適用性提供了理論基礎(chǔ)。Taoukis等[10-12]基于CheckPointTM,改變TTI中脂肪酶濃度,研究了其在冷凍狀態(tài)下的動(dòng)力學(xué)模型。選擇揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)作為表征冷鏈?zhǔn)称沸迈r程度的理論指標(biāo),感官評(píng)分作為冷鏈?zhǔn)称沸迈r程度的實(shí)際指標(biāo),發(fā)現(xiàn)這種酶型TTI能有效地對(duì)藍(lán)鯊片、魷魚(yú)片和牡蠣等冷凍產(chǎn)品在分配、儲(chǔ)存、銷售等過(guò)程中的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè),預(yù)估出產(chǎn)品在儲(chǔ)存期任何時(shí)候的剩余保質(zhì)期,從而能優(yōu)化和管理食品的冷鏈運(yùn)輸。

Kim等將脂肪酶型TTI系統(tǒng)用于監(jiān)測(cè)碎牛肉的質(zhì)量變化[13]。選用三己酸甘油酯作為脂肪酶水解底物,基于具有溫度依賴性的假單胞菌屬的生長(zhǎng)來(lái)研究碎牛肉的腐敗情況。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,牛肉中假單胞菌屬腐敗的活化能是47.5 kJ/mol,而制備的TTI活化能是35.8 kJ/mol,兩者活化能相似,且在兩種動(dòng)態(tài)儲(chǔ)存條件下,TTI系統(tǒng)的終點(diǎn)接近于碎牛肉的保質(zhì)期。因此,該TTI系統(tǒng)是監(jiān)測(cè)碎牛肉在分配和儲(chǔ)存過(guò)程中質(zhì)量變化的有效工具。郭素娟等[14]利用脂肪酶TTI監(jiān)測(cè)羊肉的質(zhì)量變化，選用三丁酸甘油酯作酶底物,優(yōu)化反應(yīng)條件,確定最佳的反應(yīng)體系，使用的酸堿指示劑在 pH9.0～6.0范圍內(nèi)的顏色變化趨勢(shì)是紫紅色、藍(lán)色、綠色、黃色,能較好地進(jìn)行肉眼識(shí)別。TTI的顏色變化與羊肉的新鮮程度相一致,能方便、快捷地指導(dǎo)羊肉的生產(chǎn)和消費(fèi)。

1.2 淀粉酶型

淀粉與碘作用形成藍(lán)色包合物,淀粉在淀粉酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng),聚合度或相對(duì)分子質(zhì)量逐漸降低,導(dǎo)致包合物發(fā)生褪色,由藍(lán)色變成無(wú)色,且褪色速度與溫度和時(shí)間有關(guān)。因此,基于淀粉的水解反應(yīng),可以制備淀粉酶型TTI,用于指示食品的新鮮程度。

Sun等[15]將淀粉和碘的混合溶液烘干后與淀粉酶混合,得到的固態(tài)粉末再與水一起封裝,開(kāi)發(fā)出了一種低成本的淀粉酶型TTI體系，研究了不同淀粉酶含量下TTI的顏色變化與時(shí)間和溫度的關(guān)系,并進(jìn)行了數(shù)學(xué)模擬，通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉酶和淀粉的比例,可以將TTI的活化能控制在102～110 kJ/mol范圍內(nèi),以適應(yīng)具有不同活化能的食物。錢(qián)靜等[16]基于糖化酶水解麥芽糊精的反應(yīng),開(kāi)發(fā)出了一種新型的淀粉酶型TTI。改變糖化酶的加入量,可以得到活化能分別是88.59、78.95和69.76 kJ/mol的三種TTI模型,應(yīng)用于因脂肪氧化或微生物增長(zhǎng)而造成質(zhì)量損失的食品。其中,活化能是78.95 kJ/mol的TTI可用于指示冷藏條件下,保質(zhì)期是5 d的冷鮮肉的質(zhì)量變化[17]。

Rajan等[18]利用淀粉酶型TTI監(jiān)測(cè)冷凍牛肉的高溫融化過(guò)程，將裝有淀粉酶和淀粉-碘復(fù)合物混合液的聚乙烯袋子粘貼在冷凍牛肉的保鮮膜外側(cè),分別在25、37 ℃下加熱解凍。25 ℃時(shí),TTI在18 h后由最初的藍(lán)黑色變成最終的黃色;37 ℃時(shí),TTI顏色到達(dá)終點(diǎn)所需時(shí)間為12 h。在牛肉加熱融化過(guò)程中,該TTI的顏色變化與各種肉質(zhì)參數(shù)的變化相吻合,可以成功地用于評(píng)估冷凍牛肉的高溫融化歷史。Brizio等[19]將淀粉酶型TTI用于指示易腐家禽運(yùn)輸鏈中的質(zhì)量變化(圖2)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室、工廠和銷售點(diǎn)的測(cè)試,證明了TTI的保質(zhì)期可通過(guò)改變淀粉酶濃度來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)矸勖傅馁|(zhì)量是淀粉質(zhì)量的60%時(shí),TTI的活化能是22.29 kJ/mol,可在4 ℃下保存10 d,最適合用于冷凍雞胸肉的運(yùn)輸。

圖2 淀粉酶型TTI的反應(yīng)原理Fig.2 Reaction principle of the amylase type TTI system

1.3 蟲(chóng)漆酶型

蟲(chóng)漆酶是一種銅離子氧化酶,具有廣泛的作用底物,可催化氧化酚類化合物、二胺、芳香胺、苯硫醇等底物,使反應(yīng)溶液顏色發(fā)生變化,結(jié)合時(shí)間和溫度的累積效應(yīng),可制備蟲(chóng)漆酶型TTI。將蟲(chóng)漆酶應(yīng)用于酶型TTI有以下優(yōu)點(diǎn):a. 蟲(chóng)漆酶的作用底物廣泛,對(duì)不同底物的氧化速率不同。因此,可以通過(guò)改變蟲(chóng)漆酶的作用底物,調(diào)控TTI的活化能值,開(kāi)發(fā)出具有寬活化能范圍的TTI;b. 蟲(chóng)漆酶的酶催化機(jī)理簡(jiǎn)單,蟲(chóng)漆酶型TTI的反應(yīng)速率與時(shí)間的變化成線性關(guān)系,動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)單;c. 蟲(chóng)漆酶安全環(huán)保,基于蟲(chóng)漆酶的TTI在意外破裂引起溢出的情況下也是安全的。

Kim等[20]選用愈創(chuàng)木酚作為蟲(chóng)漆酶的反應(yīng)底物,牛血清白蛋白作酶穩(wěn)定劑,利用愈創(chuàng)木酚在蟲(chóng)漆酶作用下的氧化變色作指示劑,研發(fā)出了蟲(chóng)漆酶TTI模型。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,該TTI的顏色變化與愈創(chuàng)木酚的氧化速率成線性關(guān)系,且改變蟲(chóng)漆酶的加入量可將TTI的活化能值控制在43～47 kJ/mol范圍內(nèi),能直觀地評(píng)估由酶促變化、水解和脂質(zhì)氧化引起的食品質(zhì)量變化。

疊氮化鈉(NaN3)能可逆地與蟲(chóng)漆酶的底物結(jié)合位點(diǎn)以外的位點(diǎn)結(jié)合,抑制其酶活性?；诖?Park等[21]又進(jìn)一步研究了NaN3對(duì)蟲(chóng)漆酶TTI的影響。結(jié)果表明NaN3可以改變TTI的活化能,使其隨著NaN3含量的增加而升高,并將其控制在48～110 kJ/mol范圍,精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)各種食品的質(zhì)量變化。當(dāng)NaN3的濃度是7 μmol/L時(shí),TTI的活化能是99 kJ/mol,可用于監(jiān)測(cè)朝鮮泡菜的發(fā)酵過(guò)程[22]。

1.4 脲酶型

脲酶是一種含鎳的寡聚酶,能催化尿素水解生成碳酸和兩分子氨,并釋放出氨氣和二氧化碳,使溶液的pH增加,酸堿指示劑顏色發(fā)生變化。脲酶催化尿素水解的反應(yīng)速率與溫度密切相關(guān),在一定溫度范圍內(nèi),溫度越高,反應(yīng)速率越快。因此,基于此反應(yīng)可構(gòu)建脲酶型TTI體系。

吳秋明[23]以脲酶催化尿素水解反應(yīng)為基礎(chǔ),改變緩沖溶液的種類、pH指示劑的種類和尿素底物的濃度,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,開(kāi)發(fā)出了各組分最佳的脲酶型TTI體系。通過(guò)研究TTI的動(dòng)力學(xué)行為,確定了體系的反應(yīng)函數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù),其活化能值是22.5 kJ/mol,具有指示食品剩余貨架期的可行性。吳丹等[24]將脲酶加入到尿素的磷酸緩沖溶液中,利用酚紅酸堿指示劑的顏色變化,構(gòu)建了脲酶TTI模型；隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,TTI系統(tǒng)由黃色變?yōu)榧t色；研究了顏色變化的動(dòng)力學(xué),建立了顏色隨時(shí)間和溫度變化的數(shù)學(xué)關(guān)系,測(cè)得該TTI的活化能為23.05 kJ/mol,可用于監(jiān)測(cè)具有相似活化能值的食物質(zhì)量。

1.5 酪氨酸酶型

酪氨酸在酪氨酸酶的作用下能被催化氧化成多巴胺中間體,再進(jìn)一步被氧化成多巴色素,使反應(yīng)溶液由無(wú)色變成褐色,再變成最終的黑色,且溫度越高,反應(yīng)速度越快。因此,可基于此反應(yīng)制作酪氨酸酶型TTI。

葛雷等[25]基于酪氨酸酶開(kāi)發(fā)了一種新型的酶促TTI體系。該TTI由酪氨酸和酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液組成,利用酪氨酸在酪氨酸酶作用下的顏色變化作指示,制備簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),進(jìn)行數(shù)學(xué)模型分析。結(jié)果表明該TTI體系在冷藏條件下,48 h后溶液顏色變?yōu)楹谏?指示時(shí)間約為2 d,適用于監(jiān)測(cè)極易腐敗食品或者要求鮮食的高檔水產(chǎn)品的質(zhì)量變化。

1.6 其他酶型

過(guò)氧化物酶是一類氧化還原酶,在H2O2存在下能氧化酚類和胺類化合物,如2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二胺、抗壞血酸等。ABTS在過(guò)氧化物酶和H2O2作用下被氧化成陽(yáng)離子自由基,使溶液顏色發(fā)生變化,可用于構(gòu)建TTI。Rani等[26]從菊科植物紫莖澤蘭中分離提純出過(guò)氧化物同工酶,該酶具有較好的熱穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)可行性,并進(jìn)一步構(gòu)建了酶型TTI。TTI體系由三部分組成:頂層是H2O2,中間層是低熔點(diǎn)的油脂(如椰子油、酥油和黃油),底層是過(guò)氧化物酶和底物ABTS。在低溫環(huán)境下,中間的油脂呈固態(tài),阻止氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行;溫度升高后固態(tài)的油脂融化,TTI體系被激活,ABTS被氧化,溶液由無(wú)色變成深綠色。實(shí)驗(yàn)中研究了TTI變色的動(dòng)力學(xué),測(cè)得其活化能值是120.14 kJ/mol。向體系中加入Hg2+、K+、Ca2+或NaCl可以提高酶的催化活性,加入Mg2+、Zn2+、Mn2+或NaN3可以抑制酶的催化活性,從而可以調(diào)控酶促反應(yīng)的活化能,開(kāi)發(fā)出一系列過(guò)氧化物酶型TTI。

聚羥基丁酯(PHB)是一種熱塑性可生物降解的聚合物,通過(guò)熱處理和溶劑輔助處理可加工成均勻的薄膜,其價(jià)格低廉,能被多種PHB解聚酶降解,因此可用于開(kāi)發(fā)TTI。Anbukarasn等[27]在PHB薄膜上負(fù)載酞青染料,在解聚酶的作用下,PHB發(fā)生降解,導(dǎo)致染料在溶液中的釋放,隨著時(shí)間的推移溶液經(jīng)歷從透明到藍(lán)色的顏色轉(zhuǎn)變,研發(fā)出解聚酶TTI。實(shí)驗(yàn)中研究了染料釋放速率和降解活化能,動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明37 ℃時(shí)染料在6 h內(nèi)完全釋放;4 ℃時(shí)染料在7 d內(nèi)完全釋放,PHB降解的活化能是74 kJ/mol,可用于監(jiān)測(cè)牛奶、鮮肉等食品的保質(zhì)期和質(zhì)量損失,如圖3所示。

圖3 基于染料負(fù)載的PHB膜發(fā)生 酶促降解反應(yīng)構(gòu)建的TTI示意圖Fig.3 Schematic showing of TTI based on the enzymatic degradation of the dye-loaded PHB film

葡萄糖氧化酶在有氧條件下能專一地催化氧化β-D-葡糖,生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫,使溶液的pH降低,導(dǎo)致pH指示劑顏色發(fā)生變化,從而可用于制備葡萄糖氧化酶型TTI。Rahman等[28]基于葡萄糖氧化酶的氧化反應(yīng),研發(fā)出了一種新型的生物傳感TTI系統(tǒng)。該系統(tǒng)由葡萄糖氧化酶、葡萄糖、pH指示劑和三電極恒電位儀組成,其中電位儀產(chǎn)生的電信號(hào)隨體系顏色的變化而改變。分析該響應(yīng)裝置的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和溫度依賴性,測(cè)定體系顏色和電流信號(hào)的變化速率,測(cè)得體系顯色反應(yīng)的活化能值是24.2 kJ/mol,電流反應(yīng)的活化能是25 kJ/mol。兩者相似的活化能值表明在預(yù)測(cè)食品質(zhì)量時(shí),依據(jù)電信號(hào)和顏色變化具有相同的效果。因此,基于葡萄糖氧化酶的TTI充當(dāng)了具有顯著電流變化的生物傳感器,在監(jiān)測(cè)食品質(zhì)量變化過(guò)程中可以提供有效的數(shù)字信息,而不是顏色的可見(jiàn)變化這樣的模擬信息,具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

液態(tài)酶型TTI種類豐富、制備簡(jiǎn)單。然而,在實(shí)際使用中,液態(tài)酶型TTI受到一定程度的限制,其主要原因有：a. 基于脂肪酶、淀粉酶和脲酶的TTI中需要額外加入指示顏色變化的試劑,會(huì)使反應(yīng)體系變得復(fù)雜;蟲(chóng)漆酶和酪氨酸酶價(jià)格相對(duì)較高,不利于TTI的商業(yè)化應(yīng)用;其他酶型的TTI研究相對(duì)較少,有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)；b. 雖然通過(guò)改變底物濃度、酶溶液濃度以及輔酶、抑制劑和緩沖劑的配方,可以調(diào)節(jié)液態(tài)酶型TTI的反應(yīng)速率和活化能,擴(kuò)大其應(yīng)用范圍,但液態(tài)下酶不穩(wěn)定,容易失活,且液態(tài)酶型TTI對(duì)包裝的機(jī)械強(qiáng)度有較高要求,否則容易發(fā)生泄漏,污染食品[29]。

2 固態(tài)酶型TTI

液態(tài)酶型TTI的不穩(wěn)定性、易失活性和易泄漏性限制了其商業(yè)化應(yīng)用。因此,改變TTI中酶的存在形態(tài),從而建立固態(tài)酶型TTI成為了研究酶型時(shí)間溫度指示劑的一個(gè)新方向。固態(tài)酶型TTI一般是基于固定化酶技術(shù),再利用酶化學(xué)反應(yīng)和擴(kuò)散原理構(gòu)建而成的[30]。

2.1 酶的固定化方法

固定化酶是將酶分子限制在與酶底物或產(chǎn)物基質(zhì)/載體不同的固體基質(zhì)/載體上,主要通過(guò)吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法四種方法實(shí)現(xiàn)[31],如圖4所示。

圖4 不同的固定化酶方法Fig.4 Various methods of enzyme immobilization

2.1.1 吸附法 吸附法是利用離子鍵或物理吸附將酶固定在載體基質(zhì)表面。根據(jù)吸附方法的不同,可分為離子吸附法和物理吸附法。離子吸附法依賴于酶分子與含有離子交換殘基且不溶于水的載體之間的離子結(jié)合,通常使用的載體材料主要是多糖和具有離子交換中心的聚合物。物理吸附法是酶通過(guò)范德華力、氫鍵相互作用、疏水作用等微弱的力而粘附在基質(zhì)表面,最常用的基質(zhì)材料是水溶性載體,如多糖衍生物、玻璃、聚合物等。

2.1.2 包埋法 包埋法是將酶捕獲到凝膠格子或半透性聚合物膜中,形成格子型和微膠囊型兩種包埋形式。在該方法中,酶不與載體基質(zhì)結(jié)合。

2.1.3 交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)耦合,形成不溶于水的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而進(jìn)行固定化。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、順丁烯二酸酐、胱胺二鹽酸鹽等,酶中游離的氨基、羧基、巰基、咪唑基及酚基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。

2.1.4 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是利用酶?jìng)?cè)鏈的氨基酸殘基(如半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸等),通過(guò)與載體之間形成共價(jià)鍵而將酶固定化。通過(guò)保護(hù)酶的活性位點(diǎn)可以獲得高效的酶活性,常用的保護(hù)方法有:a. 形成可逆的酶-抑制劑復(fù)合物;b. 對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾,利用新殘基與載體共價(jià)結(jié)合;c. 加入酶原前體。

固定化酶能夠有效地提高酶的生物活性、穩(wěn)定性、循環(huán)使用性和機(jī)械強(qiáng)度,且使酶促反應(yīng)更易控制。因此,將固定化酶技術(shù)引進(jìn)到酶型TTI中,構(gòu)建固態(tài)酶型TTI是一個(gè)研究熱點(diǎn),國(guó)內(nèi)外科學(xué)家報(bào)道了不同類型的固態(tài)酶型TTI。

2.2 不同類型的固態(tài)酶型TTI

2.2.1 脂肪酶型 聚乙烯醇(PVA)水凝膠具有制備簡(jiǎn)單、毒性低、吸水量高、良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn),是一種常用的固定化酶載體[32]。喬磊等[33]、Lu等[34]將三乙酸甘油酯底物、堿性脂肪酶和酸堿指示劑固定到PVA凝膠中,通過(guò)冷凍-解凍循環(huán)法制備了固態(tài)脂肪酶型TTI。其中,TTI的上蓋是三乙酸甘油酯的底物凝膠,下層是包含脂肪酶和溴百里酚藍(lán)在內(nèi)的酶基凝膠,如圖5所示。使用時(shí),將上蓋壓在含酶底板上,使底物凝膠與酶基凝膠接觸,酶促反應(yīng)被激活,形成一條黃色帶。根據(jù)黃色帶的擴(kuò)散長(zhǎng)度來(lái)判斷TTI對(duì)時(shí)間、溫度的積累效應(yīng),監(jiān)測(cè)冷鮮豬肉和牛奶在生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)和銷售過(guò)程中的質(zhì)量狀況。喬磊等[35]一步研究發(fā)現(xiàn)未激活前,該TTI體系在0 ℃下貯藏180 d仍可以保持88%的相對(duì)酶活性,顯著提高了其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

圖5 固態(tài)脂肪酶型TTI的物理模型Fig.5 The physical model of the solid-state lipase type TTI

2.2.2 淀粉酶型 玻璃微珠具有比表面積大、機(jī)械高度高、耐酸堿性好等有點(diǎn),是一種優(yōu)良的酶載體[36]。Guiavarc等[37]將淀粉酶、蔗糖和鹽以合適的比例吸附在玻璃微珠表面,開(kāi)發(fā)出了固態(tài)淀粉酶型TTI,并在低濕度條件下對(duì)其進(jìn)行研究。該TTI在溫度范圍是100～132 ℃的等溫條件下表現(xiàn)出顯著的熱穩(wěn)定性。當(dāng)環(huán)境的相對(duì)濕度是0.48時(shí),TTI在30 min內(nèi)的Z值(熱力殺菌時(shí)對(duì)象菌的熱力致死時(shí)間曲線的斜率)是9.4 ℃,平均誤差是14%,可用于設(shè)計(jì)、控制和優(yōu)化低酸性罐頭食品的滅菌過(guò)程。

海藻酸鈉是一種由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古羅糖醛酸組成的線性聚合物,具有良好的生物相容性和降解性,可在溫和條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的包埋[38]。孟晶晶等[39]利用海藻酸鈉制備出糖化酶的微膠囊顆粒,從而研發(fā)出了固態(tài)糖化酶型TTI。該TTI由兩個(gè)獨(dú)立的部分組成:覆蓋物和反應(yīng)體。反應(yīng)體由糖化酶微膠囊、淀粉、碘和海藻酸鈉組成,并涂在紙上,覆蓋物是3%的瓊脂水凝膠,將兩部分結(jié)合即可激活TTI(圖6)。改變各組分的含量及瓊脂層的厚度,得到7組可用于4 ℃條件下的TTI配方,其活化能值在87～107 kJ/mol范圍內(nèi),可用于指示不同冷藏產(chǎn)品的貨架期。當(dāng)糖化酶加入量是0.03 g,瓊脂凝膠是3.75 mL,麥芽糊精質(zhì)量濃度是40 g/L時(shí),TTI的活化能是54.14 kJ/mol,在恒溫和變溫兩種條件下能準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)酸奶品質(zhì)變化,預(yù)測(cè)酸奶的保質(zhì)期[40]。

圖6 固態(tài)淀粉酶型TTI的結(jié)構(gòu)組成Fig.6 The configuration of the solid-state amylase type TTI structure

2.2.3 酪氨酸酶型 冷凍-解凍法,也稱物理交聯(lián)法,是目前制備PVA凝膠最常用的一種方法[41]。徐鳳娟等[42]以酪氨酸和酪氨酸酶為研究對(duì)象,利用冷凍-解凍成膜方法,分別制備了負(fù)載有酪氨酸和酪氨酸酶的聚乙烯醇凝膠薄膜;把這兩種薄膜粘附在一起,即可制備固態(tài)酪氨酸酶型TTI。這種TTI反應(yīng)體系構(gòu)成簡(jiǎn)單,無(wú)需加入任何指示劑,且由無(wú)色至黑色的顏色變化過(guò)程更加方便肉眼觀察,如圖7所示。在此基礎(chǔ)上,李振興等優(yōu)化了固態(tài)酪氨酸酶型TTI的組分，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化分析確定了TTI中各組分的最佳含量,即酪氨酸用量30.08 mg、酪氨酸酶用量0.30 mL、PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.18%，此時(shí)TTI的活化能值是40.9 kJ/mol,其在4 ℃下最長(zhǎng)指示時(shí)間可以達(dá)到50.48 h,能有效地監(jiān)測(cè)生魚(yú)片在分配和儲(chǔ)存過(guò)程中的質(zhì)量變化[43]。

圖7 固態(tài)酪氨酸酶型TTI的顏色隨時(shí)間變化情況Fig.7 Color changes of the tyrosinase-based TTI with time

2.3 固態(tài)酶型TTI的改進(jìn)方法

固態(tài)酶型TTI的穩(wěn)定性好,機(jī)械強(qiáng)度大,使用方便[44],但目前所使用的固定化酶載體材料比較傳統(tǒng)單一,容易限制酶的擴(kuò)散,影響其進(jìn)一步應(yīng)用。因此,通過(guò)改進(jìn)固定化酶的載體材料,能有效地提高酶的擴(kuò)散能力,豐富酶型TTI的類型,擴(kuò)大應(yīng)用范圍,為其商業(yè)化應(yīng)用提供可能。改進(jìn)方法可從以下幾個(gè)方面入手:

a. 利用溫度敏感型材料用于酶的固定化。一些兩性離子型單體的聚合物(如聚N-丙烯酰甘氨酰胺(PNAGA)、聚甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿(PDMAPS)、聚[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)銨(PDMMPPS)等)具有最高臨界溶解溫度(UCST),基于此種聚合物可制備熱響應(yīng)型智能材料,并用于固定化酶。如張倩等[45]將胰蛋白酶固定到PNAGA表面,Cummings等[46]將糜蛋白酶固定到PDMAPS側(cè)鏈。利用具有UCST的材料作固定化酶載體,并構(gòu)建酶型TTI時(shí),在低溫條件下,載體材料呈收縮聚體狀態(tài),酶不易發(fā)生擴(kuò)散,TTI不易被激活;溫度升高,載體材料發(fā)生溶脹,有利于酶的擴(kuò)散,能有效地激活TTI。由于具有UCST的溫敏性材料在不同溫度條件下能發(fā)生相轉(zhuǎn)變,且這種轉(zhuǎn)變與TTI的溫度變化相符,因此可作為新型的固定化酶載體用于開(kāi)發(fā)酶型TTI。

b. 利用pH敏感型材料用于酶的固定化。pH敏感型材料是一種可離子化的兩性電解質(zhì)高分子,一般含有酸性基團(tuán)(如羧基、磺酸基)或堿性基團(tuán)(如氨基)[47]。當(dāng)含有酸性基團(tuán)時(shí),在低pH下,材料中的大分子鏈間氫鍵相互作用較強(qiáng),材料發(fā)生脫水收縮,不溶或溶脹率較低;隨著pH的升高,酸性基團(tuán)給出質(zhì)子,通過(guò)解離使材料發(fā)生溶解或溶脹。這類材料適合用于酶促反應(yīng)時(shí)使溶液pH升高的酶(如脲酶)的固定化載體,進(jìn)而構(gòu)建酶型TTI。當(dāng)含有堿性基團(tuán)時(shí),材料在高pH下不溶或溶脹率較低,在低pH下堿性基團(tuán)質(zhì)子化,發(fā)生溶解或溶脹,適合用作酶促反應(yīng)時(shí)使溶液pH降低的酶(如脂肪酶、葡萄糖氧化酶)的固定化載體,應(yīng)用于酶型TTI中。因此,基于pH敏感型材料在不同pH下的溶解或溶脹率不同,可開(kāi)發(fā)出智能的酶型TTI。

c. 利用酶-無(wú)機(jī)雜化納米花材料用于酶的固定化。酶-無(wú)機(jī)雜化納米花由Ge等[48]首次提出,是酶分子與無(wú)機(jī)金屬離子(如鈣、鐵、鋅等)通過(guò)自組裝而形成的花狀晶體復(fù)合物?；罱Y(jié)構(gòu)使復(fù)合物具有高表面積(圖8),能顯著地提高酶的穩(wěn)定性、生物活性和循環(huán)使用性。納米花的制備條件簡(jiǎn)單、環(huán)保,且具有普適性,適用于多種酶,如脂肪酶[49]、淀粉酶[50]、蟲(chóng)漆酶[51]、葡萄糖氧化酶[52]等。因此,基于酶-無(wú)機(jī)雜化納米花這一新型雜化材料可以對(duì)多種酶進(jìn)行固定化,進(jìn)一步用于構(gòu)建酶型TTI。

圖8 酶-無(wú)機(jī)雜化納米花的掃描電鏡圖和示意圖Fig.8 Scanning electron micrograph and schematic diagram of enzyme-inorganic hybrid nanoflowers

3 展望

與傳統(tǒng)的食品包裝相比,酶型TTI作為一種新型的智能包裝形式,通過(guò)視覺(jué)變化的方式提醒消費(fèi)者產(chǎn)品可能遭受的溫度變化情況,在易腐食品從準(zhǔn)備和包裝到運(yùn)輸再到商店零售和顧客購(gòu)買(mǎi)的過(guò)程中起著重要的作用,可以為人們提供食品供應(yīng)鏈中關(guān)于食品質(zhì)量的有用信息。隨著新材料和新技術(shù)的產(chǎn)生,未來(lái)酶型TTI將會(huì)向低成本制作、精確化檢測(cè)以及智能化控制方向發(fā)展,在食品包裝上的應(yīng)用也將大放異彩。在不久的將來(lái),以酶型TTI為代表的智能包裝方式也必將通過(guò)科技的創(chuàng)新與進(jìn)步,不斷地滿足人們對(duì)于品質(zhì)與安全的更高要求,更好地服務(wù)食品智能包裝行業(yè)。