左澤紅,魏 韜,郭麗瓊,*,林俊芳,*,張中浩

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系,廣東廣州 510640; 2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510640)

蛋氨酸,又稱甲硫氨酸,是人和動物體內(nèi)唯一的含硫必需氨基酸,在動物飼料[1-2]、食品和醫(yī)藥[3]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。蛋氨酸原材料的獲得方法主要有化學(xué)合成法[4]、微生物發(fā)酵法[5-8]和酶法。其中,酶法合成以高絲氨酸為原料,通過高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(homoserine acetyltransferase,HTA)乙?；癁镺-乙酰高絲氨酸,再經(jīng)過直接硫化或者轉(zhuǎn)硫化途徑最終生成蛋氨酸[9](見圖1)。該法操作簡單,綠色安全,是目前最具有應(yīng)用前景的生產(chǎn)方式。而HTA作為該法中的第一個酶,對蛋氨酸的合成至關(guān)重要。

圖1 蛋氨酸生物合成途經(jīng)Fig.1 Methionine biosynthesis pathway注:CGS:胱硫醚c-合成酶;CBL:胱硫醚b-裂解酶; OAHS:鄰乙酰轉(zhuǎn)移酶硫氫化酶;MS:蛋氨酸合成酶。

HTA屬于α/β水解酶超家族[10],自1967年首次從真菌中發(fā)現(xiàn)HTA以來[11],已發(fā)現(xiàn)近90種來源于不同屬的HTA。目前已發(fā)現(xiàn)的HTA主要來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等[12-14],而在食用菌中尚未見報道。平菇(Pleurotusostreatus)是一種常見的灰色食用菇。根據(jù)已公布的P.ostreatusPC15基因組注釋結(jié)果,其基因組可能含有編碼HTA的基因,可作為蛋氨酸酶法合成的備選基因。

為研究不同來源HTA在蛋氨酸酶法合成中的情況,國內(nèi)外多個研究小組進(jìn)行了不同角度的嘗試。1987年,Yamagata[15]研究了一株野生型和六株甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的HTA,其中,4株缺陷型菌株的細(xì)胞提取物中顯示出了酶活性,分別為24.7、1.52、20.3及7.22 mU/mg。劉琳[16]以pET-22b(+)為表達(dá)載體,將來源于鉤端螺旋體的hta基因在大腸桿菌BL21中表達(dá),其酶活為0.033 U/mg。后來，Thangavelu等[17]以pDEST42為表達(dá)載體,將來源于金黃色葡萄球菌的hta基因在大腸桿菌BL21中表達(dá),并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定,高絲氨酸和乙酰輔酶A的Kcat/Km分別為3×10、4×105M-1S-1。其中,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白酶表達(dá)系統(tǒng)[18],具有遺傳背景清晰、生長迅速、表達(dá)高效、待選質(zhì)粒和宿主多等優(yōu)點[19]。但是,該系統(tǒng)也存在一定的缺點和局限性,如二硫鍵形成能力較弱[20]、缺乏真核細(xì)胞蛋白翻譯后的修飾系統(tǒng)[21-22]、表達(dá)的異源蛋白經(jīng)常以不溶且無催化活性的包涵體形式存在等。故而,探究重組蛋白在大腸桿菌中的有效可溶性表達(dá)具有較高的學(xué)術(shù)價值和應(yīng)用前景。為減少包涵體、提高外源蛋白的可溶性表達(dá)量,一般有宏觀和微觀兩種解決方式,宏觀上,通過對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化以提高蛋白酶的可溶性表達(dá)[23];微觀上,通過尋找合適的表達(dá)載體和表達(dá)宿主來提高外源蛋白的有效可溶性表達(dá)。

針對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢及提高外源蛋白有效可溶性表達(dá)的解決辦法,本研究以臺灣白平菌絲球總RNA為模板,通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆獲得了hta基因,并利用網(wǎng)上在線工具分析了該基因及其蛋白質(zhì)序列,再以pET-32a(+)為表達(dá)載體,將重組質(zhì)粒pET32a-hta在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實現(xiàn)表達(dá),為了提高可溶性HTA蛋白在大腸桿菌的表達(dá)水平,對異丙基硫-β-半乳糖苷(IPTG)終濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行了優(yōu)化,同時,也探究了不同表達(dá)載體、宿主對HTA比活力的影響,以期為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)蛋氨酸打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平菇菌種(臺灣白平) 江蘇省高郵市科學(xué)食用菌研究所;克隆載體pMDTM18-T Takara;表達(dá)載體pET32a(+) 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉玉煥教授贈送;表達(dá)載體pET22b(+) 艾瑞生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta gami(DE3)plysS 上海唯地生物技術(shù)有限公司;Ex Taq酶、2×PCR Mix酶 東盛生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I、T4 DNA連接酶 賽默飛世爾科技有限公司;HP Fungal RNA Kit 飛揚生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒 美基生物科技有限公司;TransScript one-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis superMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;Bradford Protein Assay Kit Takara;Super-Pref PAGE Gel(12%,15well)蛋白膠 廣州紐新生物科技有限公司。

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;ZS-RSD3臺式恒溫振蕩器 上海旻泉儀器有限公司;SKJH-1109超凈工作臺 上海蘇坤有限公司;ETC811基因擴增儀 東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司;EPS-300核酸電泳儀 上海天能科技有限公司;Basic 041BR蛋白質(zhì)電泳儀、GelDoCTMXR+凝膠快速成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;LC-2030高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶基因hta的克隆 根據(jù)已報道的P.ostreatusPC15中的hta基因(Genbank登錄號:KDQ30216.1)的核苷酸序列,利用軟件Primer5設(shè)計PCR擴增引物,其中上游引物為HTA-F:5′-ATGGCGGCTTTCGCAAATCTCAT-3′,下游引物為HTA-R:5′-TTACCATCTTGTGATATCGACC TCCGC-3′。采用Fungal RNA Kit試劑盒提取平菇菌絲球總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一鏈,以cDNA的第一鏈為模版進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)體系為:1 μL 模版,上、下游引物各2 μL,5 μL 10×Ex Taq Buffer,4 μL dNTP Mixture,0.25 μL Ex taq,加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸81 s,30個循環(huán),72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收后與克隆載體pMDTM18-T于4 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌落PCR驗證后,將結(jié)果呈陽性的克隆子送往廣州天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測序。

表1 質(zhì)粒的多克隆位點、抗生素抗性及誘導(dǎo)劑分析Table 1 Analysis of multiple cloning sites,antibiotic resistance and inducer of plasmid

1.2.2 高絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶hta基因序列分析 使用網(wǎng)上在線軟件ExPAS-ProtParam tool、Protscale、PSIPRED、SWISS-MODEL分析hta基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3hta基因表達(dá)載體的構(gòu)建 以陽性克隆子測序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-hta為模版,在上、下游引物的5′端分別加上酶切位點EcoRI和SalI進(jìn)行PCR擴增,回收獲得的PCR產(chǎn)物與空載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和Sal I進(jìn)行雙酶切,回收目的基因及載體DNA片段后用T4 DNA 連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌落PCR及測序驗證后,獲得含有重組表達(dá)載體(pET32a-hta)的重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)。

1.2.4 重組菌的hta基因誘導(dǎo)表達(dá)及其產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp+)中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng);以1%的接種量將1 mL活化后的菌液接種于100 mL LB(含100 μg/mL Amp+)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,16 ℃、120 r/min誘導(dǎo)表達(dá)16 h。發(fā)酵液于4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,用10 mL的PBS(pH7.4)重懸菌體,冰浴超聲破碎(300 W,工作時間3 s,間歇時間3 s,全程時間5 min)后,4 ℃、8000 r/min離心10 min,收集上清,沉淀溶于等量的PBS(pH7.4)中,上清液、沉淀液分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,待電泳結(jié)束后將蛋白膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min,再換脫色液過夜脫色至膠塊上出現(xiàn)清晰條帶,用GelDoCTMXR+凝膠快速成像系統(tǒng)拍照,根據(jù)蛋白電泳條帶粗步分析HTA蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 重組菌的hta基因誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 為了探究重組酶的最優(yōu)表達(dá)條件,按1.2.4的方法分別對誘導(dǎo)溫度、IPTG終濃度、誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)SDS-PAGE電泳條帶粗步分析HTA蛋白的表達(dá)情況,以期得到最適的表達(dá)條件。

1.2.5.1 誘導(dǎo)溫度對重組蛋白表達(dá)的影響 設(shè)置IPTG終濃度為0.5 mmol/L,分別在溫度37、30、25、20、16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h。

1.2.5.2 IPTG終濃度對重組蛋白表達(dá)的影響 設(shè)置IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L,在25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h。

1.2.5.3 誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)的影響 設(shè)置IPTG終濃度為0.2 mmol/L,在25 ℃下分別誘導(dǎo)4、8、12、14、16、20、24 h。

1.2.6 HTA酶活鑒定 將重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)在最適條件下誘導(dǎo)表達(dá),并按1.2.4中的方法收集菌體,超聲破碎離心后的上清液即為粗酶液,采用Protein Assay Kit試劑盒測定粗酶液中蛋白濃度。HTA酶活力單位1U為37 ℃、pH7.5的條件下,每分鐘轉(zhuǎn)化acetyl-CoA生成1 μmol CoA所需的酶量。重組酶HTA反應(yīng)體系(600 μL)為:100 mmol/L磷酸鉀(pH7.5),25%蔗糖,0.13 mmol/L乙酰輔酶A(acetyl-CoA),10 mmol/L高絲氨酸,80 μL粗酶液,37 ℃孵育30 min;其中,陰性對照設(shè)置為不含酶只含底物的反應(yīng)體系。HPLC條件為:WondaSil? C18Superb色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為磷酸鹽緩沖液(pH7.0)∶甲醇=(90∶10),檢測波長為259 nm,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。在該液相條件下對CoA標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用面積外標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量分析,并根據(jù)樣品中CoA的產(chǎn)量計算其比活力。

1.2.7 重組菌的hta基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化 為了探究重組酶的最適表達(dá)體系,選取了pET32a、pET22b 兩個表達(dá)載體,Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta gami(DE3)plysS 三個表達(dá)宿主,組合了6組體系(Rosetta/pET32a-hta、Origami B/pET32a-hta、Rosetta gami plysS/pET32a-hta、Rosetta/pET22b-hta、Origami B/pET22b-hta、Rosetta gami plysS/pET22b-hta),以BL21/pET32a-hta為參照,在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、溫度為25 ℃的條件下誘導(dǎo)表達(dá)16 h,按1.2.6的方法將上清粗酶液進(jìn)行反應(yīng)后,采用HPLC測定CoA濃度并計算比活力,以期得到最適的表達(dá)系統(tǒng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶hta基因的克隆

以HTA-F/HTA-R為引物,使用RT-PCR法從平菇中擴增hta基因片段,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得一條約為1338 bp的亮帶,與預(yù)期條帶大小一致(見圖2)。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化后,隨機挑取LB(Amp+)固體培養(yǎng)基上長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證,陽性克隆子測序后經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行核苷酸序列比對,結(jié)果與NCBI已上傳的P.ostreatusPC15基因組中的hta基因(GenBank登錄號:KDQ30216.1)DNA序列一致性為100%,說明已成功克隆hta基因。

圖2 平菇cDNA的RT-PCR擴增hta基因Fig.2 RT-PCR amplification of hta gene注:M:DNA Marker3;1、2:hta基因。

2.2 高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶hta基因功能預(yù)測分析

通過ExPAS-ProtParam tool對hta基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化分析,得到hta基因所編碼蛋白大小為49 kDa,由445個氨基組成,等電點pI 5.93。利用NCBI-Conserved Domains Search database進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)序列分析,結(jié)果顯示HTA屬于α/β水解酶超家族,結(jié)構(gòu)域序列號為c126325,結(jié)構(gòu)域匹配E值為3.07e-161。利用Signal P 3.0對該氨基酸序列進(jìn)行信號肽預(yù)測,結(jié)果表明并不存在信號肽特征。使用protscale在線分析氨基酸序列親疏水性結(jié)果如圖3所示。圖3中,正值越大,表示越疏水,負(fù)值越大,表示越親水,介于+0.5和-0.5的為兩性氨基酸,可知HTA的前后兩端無明顯的親疏水性,中間部分親水。如圖4為PSIPRED分析HTA的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果。由圖4可知,該氨基酸序列主要由無規(guī)則卷曲、螺旋和延伸鏈組成。利用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,該蛋白具有明顯的空間結(jié)構(gòu)且主要由螺旋和無規(guī)則卷曲組成,這與PSIPRED的分析預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 氨基酸序列親疏水性分析Fig.3 The hydrophilicity and hydrophobicity analysis of the amino acid sequence

圖4 HTA的二級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 The secondary structure analysis of HTA

圖5 高絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶三級結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The tertiary structure of HTA

2.3 重組菌的hta基因誘導(dǎo)表達(dá)及其產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將構(gòu)建好的表達(dá)載體pET32a-hta轉(zhuǎn)化BL21(DE3)鑒定后,按1.2.4中的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體溶于10 mL的PBS(pH7.4)中,超聲破碎釋放細(xì)胞中的蛋白,破碎液離心后可溶性蛋白主要存在于上清液中,而包涵體因其不可溶性主要聚集在沉淀中,將沉淀溶于等量的PBS(pH7.4)后,上清液、沉淀液分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出,在68.7 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白19.7 kDa)處有清晰條帶,但主要存在于菌體破碎后的沉淀中,說明HTA重組蛋白在大腸桿菌中成功得到了表達(dá),并且表達(dá)的蛋白只有少量以可溶性形式存在,而大部分重組蛋白仍以包涵體形式存在。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products注:M:蛋白Marker,圖7～圖9同; 箭頭標(biāo)注處為HTA重組蛋白。

2.4 重組菌的hta基因誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,當(dāng)溫度為25 ℃及以上溫度時,可溶性HTA蛋白的表達(dá)量相對較高;在16、20 ℃時,可溶性HTA蛋白的表達(dá)量相對較低。可能是因為溫度過低,菌體生長慢,外源蛋白表達(dá)速度低,從而導(dǎo)致最終重組蛋白中可溶性表達(dá)量減少。一般認(rèn)為溫度越高,蛋白表達(dá)越快[24],積累的蛋白多肽來不及正確折疊,而易形成無活性的包涵體;而較低的誘導(dǎo)溫度有利于重組蛋白折疊形成正確的結(jié)構(gòu),提高外源蛋白的可溶性,因此,在后續(xù)實驗中,選取25 ℃作為最適誘導(dǎo)溫度。

圖7 不同誘導(dǎo)溫度對HTA蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of different induction temperatures on HTA expression

2.4.2 IPTG濃度的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同IPTG終濃度下誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,當(dāng)IPTG終濃度為0.2、0.4 mmol/L時,上清液中可溶性HTA蛋白的表達(dá)量相對較高,再增加IPTG濃度,可溶性HTA蛋白的表達(dá)量不再增加,反倒有下降趨勢。IPTG是乳糖類似物,少量的IPTG即能誘導(dǎo)乳糖操縱子,濃度過高會對菌體產(chǎn)生毒害作用[25],影響細(xì)胞的生長狀態(tài),從而影響可溶性蛋白的表達(dá)量。因此,在后續(xù)實驗中,選取IPTG終濃度為0.2 mmol/L作為最適誘導(dǎo)劑濃度。

圖8 不同IPTG濃度對HTA蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of different IPTG concentrations on HTA expression

2.4.3 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同誘導(dǎo)時間下誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖9所示。由圖9可知,隨著誘導(dǎo)時間的增加,可溶性HTA蛋白的表達(dá)量有上升的趨勢,而在16 h以后,可溶性HTA蛋白的表達(dá)量增加并不明顯。因此,為考慮時間成本,在后續(xù)實驗中,選取誘導(dǎo)時間為16 h作為最適誘導(dǎo)時間。

圖9 不同誘導(dǎo)時間對HTA蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of different induction time on HTA expression

2.5 HTA酶活鑒定

HTA能夠催化高絲氨酸和acetyl-CoA發(fā)生反應(yīng)生成O-乙酰高絲氨酸和CoA,本實驗通過檢驗產(chǎn)物CoA的生產(chǎn)來鑒定酶活性。HPLC結(jié)果如圖10所示。圖10a中顯示CoA標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為8.357 min;圖10b中確未見到有洗脫峰的出現(xiàn),說明沒有酶的存在,產(chǎn)物不會生成;10c中反應(yīng)體系反應(yīng)后出現(xiàn)洗脫峰時間為8.359 min 左右,出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品CoA 基本一致,所以HPLC結(jié)果初步證明HTA具有轉(zhuǎn)移乙?；钚?按1.2.6中的方法計算得到其比活力為1.6 mU/mg。

圖10 HPLC檢測結(jié)果Fig.10 HPLC test results注:a:CoA標(biāo)準(zhǔn)品;b:不添加酶的陰性對照; c:添加酶液的反應(yīng)體系;箭頭標(biāo)注處為目標(biāo)產(chǎn)物峰。

2.6 表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化

7株工程菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖11所示。由圖11可知,當(dāng)表達(dá)載體為pET32a時,在68.7 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白19.7 kDa)處有清晰條帶;當(dāng)表達(dá)載體為pET22b時,在51 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白5 kDa)處有條帶,說明重組蛋白均成功得到表達(dá)。將7組表達(dá)體系誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性HTA蛋白進(jìn)行酶活檢測,結(jié)果如圖12所示。由圖12可知,當(dāng)表達(dá)載體為pET32a-hta,表達(dá)宿主為Rosetta時,工程菌Rosetta/pET32a-hta誘導(dǎo)表達(dá)的HTA比活力最高,其最高比活力為2.2 mU/mg。

圖11 不同表達(dá)體系HTA蛋白表達(dá)情況Fig.11 Expression of HTA in different expression systems

圖12 不同表達(dá)體系HTA比活力Fig.12 Specific activity of HTA in different expression systems注:1:BL21/pET32a-hta;2:Rosetta/pET32a-hta; 3:Origami B/pET32a-hta;4:Rosetta gami plysS/pET32a-hta; 5:Rosetta/pET22b-hta;6:Origami B/pET22b-hta; 7:Rosetta gami plysS/pET22b-hta。

3 討論與結(jié)論

包涵體是大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白時由于錯誤的折疊形成的蛋白質(zhì)多聚體,并無生物活性,故而,探究重組蛋白在大腸桿菌中有效的可溶性表達(dá)具有較高的學(xué)術(shù)價值和廣泛的應(yīng)用前景,但是蛋白質(zhì)的種類紛繁復(fù)雜,理化性質(zhì)各不相同,目前無法得到一個可以提高可溶性表達(dá)的通用方法,因而,針對不同的基因必須要對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,才能獲得最大程度的可溶性表達(dá)。本研究中,對hta基因的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明:當(dāng)IPTG終濃度為0.2 mmol/L,誘導(dǎo)溫度為25 ℃,誘導(dǎo)時間為16 h時,可溶性蛋白的表達(dá)量最高。

pET32a和pET22b屬于pET系列表達(dá)載體,是在原核生物中用來表達(dá)目的蛋白常用的表達(dá)載體,在T7 噬菌體啟動子和宿主菌提供的T7 RNA聚合酶的作用下能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,其中pET22b是pET系統(tǒng)中的分泌型表達(dá)載體,它主要靠載體上的pelB信號肽分泌目的蛋白到細(xì)胞周質(zhì)中,而pET32a載體則是在細(xì)胞質(zhì)中將重組蛋白進(jìn)行表達(dá)。本實驗中,當(dāng)選用pET22b載體時,可溶性蛋白的比活力相對較低,可能是因為通過超聲破碎法并未能將細(xì)胞周質(zhì)空間的重組蛋白完全釋放出來,另外本研究也采用滲透壓休克法對表達(dá)載體為pET22b的工程菌進(jìn)行周質(zhì)蛋白提取,得到結(jié)果也并不理想。因此,當(dāng)通過超聲破碎法釋放目的蛋白時,為獲得高比活力的可溶性蛋白,應(yīng)選取pET32a表達(dá)載體。

不同的宿主菌對蛋白的可溶性表達(dá)也具有一定影響,當(dāng)異源目的基因的mRNA在大腸桿菌中過表達(dá)時,tRNA的數(shù)量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性,不充足的tRNA庫可能導(dǎo)致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配,最終導(dǎo)致外源蛋白的活性喪失,而本研究所采用的表達(dá)宿主Rosetta(DE3)菌株能夠補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應(yīng)的tRNA,提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。此外,由于大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)呈還原環(huán)境,致使重組蛋白無法折疊形成正確二硫鍵,因此構(gòu)建促進(jìn)二硫鍵形成的宿主不失為一種提高蛋白可溶表達(dá)的途徑,而本研究所采用的表達(dá)宿主Origami B(DE3)菌株包含突變的硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶基因,表達(dá)主要還原途徑的兩個關(guān)鍵酶,有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白。表達(dá)宿主Rosetta gami(DE3)pLysS賦予其Rosetta(DE3)和Origami B(DE3)的優(yōu)點,本研究中當(dāng)表達(dá)宿主為Rosetta gami(DE3)pLysS時雖然解決了包涵體的問題,但可溶性蛋白的含量和比活力卻降低了,可能是因為該菌株攜帶的pLysS質(zhì)粒含有表達(dá)T7溶菌酶的基因,降低了目的基因的背景表達(dá)水平。Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)及Rosetta gami(DE3)pLysS菌株均有自己獨特的優(yōu)勢提高外源蛋白的可溶性表達(dá),具體選擇哪一種菌株還要視情況而定。當(dāng)以酶活力為參考依據(jù),本研究中選用表達(dá)宿主Rosetta(DE3)時,工程菌Rosetta/pET32a-hta誘導(dǎo)表達(dá)的HTA蛋白比活力最高,為2.2 mU/mg。