張志堅， 楊兆麗， 謝丹娥， 劉澎， 張加頌， 宋健平

（1.廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司，廣東梅州 514300；2.廣東新南方青蒿科技有限公司，廣東梅州 514300；3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405）

青蒿素哌喹片為青蒿素和哌喹組成的復方制劑，用于治療惡性瘧、間日瘧和三日瘧。該藥問世于2006年，屬于國家一類新藥，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，是廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司獨家生產(chǎn)品種。青蒿素哌喹片原標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH08022006，現(xiàn)行標準為《中國藥典》（二部）“青蒿素哌喹片”項下標準[1]，采用高效液相色譜（HPLC）法檢查有關物質(zhì)，但該法未能將哌喹與被檢成分完全分離，靈敏度和專屬性較差。因此，為嚴格控制藥品質(zhì)量，本單位決定優(yōu)化質(zhì)量標準，提高青蒿素有關物質(zhì)的靈敏度、專屬性和可靠性，本課題組參考2015年版《中國藥典》、《國際藥典》第3版[2]中“青蒿素”及其他文獻[3-6]中有關青蒿類有關物質(zhì)的測定方法，研究HPLC法測定青蒿素哌喹片中青蒿素有關物質(zhì)的方法，并建立青蒿素有關物質(zhì)限度?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20A高效液相色譜儀。賽默飛Ultimate 3000高效液相色譜儀。色譜柱：YMCTriart C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；THERMOHypersil GOLD 柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）；Welch-Xtimate柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。XP204S型萬分之一分析天平、XS205DV型十萬分之一分析天平（美國梅特勒——托利多有限公司）。

1.2試藥青蒿素哌喹片，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號：20141001、20141002、20141003；青蒿素，廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號：Y13120001；哌喹，廣東新南方青蒿藥業(yè)股份有限公司，批號：20161030；雜質(zhì)A（青蒿烯），Toronto Research Chemicals，批號：9-MMH-173-1；雜 質(zhì) B（9-epi-Artemisinin）， Toronto Research Chemicals，批號：2-NKM-68-8；雜質(zhì)I[7-氯-4-（1-哌嗪基）喹啉]，中國藥品檢定研究院，批號：101339-201501；雜質(zhì)II（7-氯-4-羥基喹啉），中國藥品檢定研究院，批號：101340-201501；雜質(zhì)Ⅲ[1，4-二（7-氯喹啉-4-基）哌嗪]，中國藥品檢定研究院，批號：101341-201501；甲醇、乙腈均為色譜級（上海安譜公司）；水為超純水；三氯乙酸（分析純，國藥集團）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗色譜條件：色譜柱為YMC-Triart C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.01%三氯乙酸（50∶50）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為35℃；進樣量為20 μL；青蒿素峰與雜質(zhì)A峰的分離度應大于4.0，相鄰色譜峰間分離度應大于1.5。系統(tǒng)適用性溶液配制：分別精密稱取青蒿素原料及其雜質(zhì)A對照品、雜質(zhì)B對照品適量，用乙腈溶解稀釋，制成含青蒿素5 mg/mL、雜質(zhì)A 7.5 μg/mL、雜質(zhì)B 15 μg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

2.2測定方法取青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于青蒿素50 mg），加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含青蒿素5 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的1.5倍。

2.3專屬性試驗

2.3.1 雜質(zhì)定位與分離試驗 按處方比例配制供試品溶液，青蒿素及其雜質(zhì)A、B對照品溶液，哌喹及其雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品溶液，不含青蒿素的陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，各雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與雜質(zhì)間分離度均達到要求，陰性不干擾測定。其中5.7 min處色譜峰為未知雜質(zhì)峰1，因其含量小于0.1%，故不需要對其進行鑒定研究。6.7 min處色譜峰為溶劑雜質(zhì)峰，在空白溶劑試驗中已經(jīng)證實過。雜質(zhì)A峰、雜質(zhì)B峰的分離度為2.43，雜質(zhì)B峰與青蒿素峰的分離度為3.56，均達到完全分離。色譜圖見圖1～3。

2.3.2 強制降解試驗 取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加入0.5 mol·L-1HCL溶液1 mL，室溫放置5 min后，加入0.5 mol·L-1NaOH溶液1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為酸破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加入0.5 mol·L-1NaOH溶液1 mL，室溫放置5 min后，加入0.5 mol·L-1HCL溶液1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為堿破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加體積分數(shù)30%過氧化氫2 mL，室溫放置3 h后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為氧化破壞樣品。取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加水2 mL后，90℃水浴2 h，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為水溶液高溫破壞樣品。樣品置105℃干燥3 h后，取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加乙腈適量超聲溶解后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為高溫破壞樣品。樣品在強光（照度為4 500±500 lx）下照射11 d后，取陰性（空白輔料+哌喹）、哌喹原料、青蒿素原料、按處方比例配制的供試品適量（約相當于青蒿素50 mg）置10 mL量瓶中，加乙腈適量超聲溶解后，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為光照破壞樣品。按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果顯示：各強制降解條件下空白溶液和空白輔料對本品制劑和原料藥有關物質(zhì)的檢測均無干擾；各強制降解條件下原料藥供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離；各強制降解條件下制劑供試品溶液中主峰與各雜質(zhì)峰、各主要雜質(zhì)峰之間均能有效分離。酸、堿、氧化、水溶液高溫、高溫及強光降解條件下，青蒿素原料供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為100.4%、100.8%、100.1%、100.0%、101.9%、100.1%，制劑供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為97.8%、90.2%、99.0%、97.7%、99.4%、97.4%，青蒿素+陰性供試品溶液的物料平衡指數(shù)分別為100.6%、90.8%、98.8%、95.0%、103.7%、102.1%，均在90.0%～110.0%之間。表明該方法對各主要降解雜質(zhì)均能較好檢出，該法能有效地檢出各破壞試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)，且各雜質(zhì)峰均能與主峰達到基線分離，專屬性較好。

2.3.3 色譜峰歸屬 方法同“2.3.2”項下強制降解試驗。根據(jù)降解試驗結(jié)果，酸、堿、氧化、水溶液高溫、高溫及強光降解條件下青蒿素分別在5.497、5.510、5.043、5.500、16.410、5.703 min保留時間之后產(chǎn)生降解產(chǎn)物，說明青蒿素有關物質(zhì)均在5 min之后產(chǎn)生。而哌喹在上述降解條件下在3～5 min之間均有降解產(chǎn)物產(chǎn)生。因空白輔料中哌喹為近期生產(chǎn)批次，不能完全模擬當時生產(chǎn)所用的空白輔料，在4 min左右的色譜峰無法解釋，但從降解試驗光譜圖分析其化學結(jié)構(gòu)，判斷是哌喹的降解產(chǎn)物，而哌喹有關物質(zhì)的研究在哌喹色譜條件下分析，在此條件下不再研究。為保證青蒿素有關物質(zhì)檢測的準確性，減少哌喹及其輔料的干擾，我們確定青蒿素有關物質(zhì)的積分起始時間為4.5 min。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of system suitability

1：溶劑雜質(zhì)；2：雜質(zhì)A；3：雜質(zhì)B；4：青蒿素

圖3 雜質(zhì)定位與分離試驗色譜圖（2）Figure 3 HPLC chromatogram of impurity location and separation test（2）

2.4檢測限與定量限分別精密量取“2.3.1”項下青蒿素及其雜質(zhì)A、B對照品溶液適量，用乙腈逐步稀釋至各樣品主峰信噪比為3∶1和10∶1，按“2.1”項下色譜條件測定。青蒿素的定量限和檢出限分別為15、5 μg/mL，雜質(zhì)A的定量限和檢出限分別為0.25、0.075 μg/mL，雜質(zhì)B的定量限和檢出限分別為10、3 μg/mL。雜質(zhì)A、B的最低檢測限濃度均低于該雜質(zhì)的報告限度濃度，反映該分析方法的靈敏度符合要求。

2.5線性關系及范圍以雜質(zhì)限度為100%，從定量限開始至雜質(zhì)限度的200%～300%，分別取8個點，以濃度橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。分別精密稱量青蒿素及其雜質(zhì)A、B對照品適量，用乙腈溶解并逐步稀釋至青蒿素濃度依次為 15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL，雜質(zhì) A 濃度依次為 0.25、1.0、5.0、10.0、15、20、25、30 μg/mL，雜質(zhì)B濃度依次為10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45 μg/mL。 按“2.1”項下色譜條件測定，得到回歸方程。青蒿素：Y=0.014 1 X+0.007 4，r=0.999 4；雜質(zhì)A：Y=0.5164 X+0.045，r=0.999 9；雜質(zhì) B：Y=0.015 7 X-0.014 3，r=0.998 1。各線性方程的相關系數(shù)（r）均大于0.990，Y軸截距均在100%響應值的25%以內(nèi)，響應因子的相對標準差均小于10%。結(jié)果表明青蒿素濃度在15～51 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，雜質(zhì)A濃度在0.3～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，雜質(zhì)B濃度在10～46 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

通過線性斜率比值計算得，雜質(zhì)A校正因子為0.027，雜質(zhì)B校正因子為0.90。參照青蒿素原料質(zhì)量標準（國際藥典和中國藥典），確定雜質(zhì)A校正因子為0.027，又因雜質(zhì)B校正因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，確定雜質(zhì)B校正因子為1.00。

2.6加樣回收率試驗分別精密稱取青蒿素哌喹片細粉適量加乙腈適量制成約相當于含青蒿素20 mg/mL的溶液，過濾后，精密量取2.5 mL，12份，分別置10 mL量瓶中。再分別精密量取對照品貯備液（含雜質(zhì)A 15 μg/mL，雜質(zhì)B 30 μg/mL）2.5、3.3、5、7.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，即得各濃度供試品溶液。濃度分別為供試品總量限度的50%、66%、100%、150%，即雜質(zhì)A約相當于主成分的0.075%、0.100%、0.150%、0.225%，雜質(zhì)B約相當于主成分的0.15%、0.20%（為雜質(zhì)B定量限）、0.30%、0.45%，每個濃度平行制備3份平行樣。按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。雜質(zhì)A的加樣回收率（n=12）為96.6%，相對標準偏差（RSD，sR）為1.04%；雜質(zhì)B的加樣回收率（n=9）為85.9%，sR為3.21%。各濃度平均回收率均在80%～120%間，相對標準偏差在10%內(nèi)。

2.7精密度試驗按“2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液和色譜條件，重復進樣6次，計算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和青蒿素峰面積的sR為0.14%、3.39%、0.02%，符合精密度實驗要求。

2.8重復性試驗分別精密稱取青蒿素哌喹片細粉適量（約相當于青蒿素50 mg），置10 mL量瓶中，精密移入0.1 mg/mL的雜質(zhì)B對照品貯備液1.5 mL，加乙腈適量溶解，定容搖勻濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。平行制備6份。按“2.1”項下色譜條件測定，計算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B含量的sR為3.23%、4.18%，符合重復性實驗要求。

2.9溶液穩(wěn)定性試驗按“2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液和色譜條件，分別于0、4、8、12、24、48 h測定，記錄色譜圖。48 h內(nèi)樣品溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和青蒿素峰面積的sR為0.41%（不超過10%）、3.68%（不超過10%）、0.64%（不超過2%），各峰面積均未出現(xiàn)顯著性變化。結(jié)果符合驗證要求，表明溶液在48 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.10耐用性試驗分別考察了不同色譜柱[YMCTriart C18（2）柱 、 THERMO-Hypersil GOLD 柱 ，Welch-Xtimate柱]，乙腈-0.01%三氯乙酸流動相不同體積比（45∶55、50∶50、55∶45），不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min），不同檢測波長（208、210、212 nm），不同三氯乙酸濃度（0.01%、0.05%、0.1%），不同柱溫（33、35、37℃），不同品牌濾膜（津騰、安譜、進口某品牌）下青蒿素與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰之間的分離度。結(jié)果均分離良好，對本品有關物質(zhì)的檢測沒有顯著影響。

2.11 3批樣品測定取3批樣品（批號：20141001、20141002、20141003），按“2.2”項下方法制備供試品溶液與對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 3批樣品有關物質(zhì)測定結(jié)果Table 1 Determination results of related substances in 3 batches of samples

3 討論

由原質(zhì)量標準方法檢測，雜質(zhì)B未檢出，反映原方法靈敏度差，但總雜含量2%，又與其青蒿素含量99%不一致，反映原方法檢測結(jié)果準確性差。由此可見，原方法檢測雜質(zhì)B檢測靈敏度低，檢測結(jié)果雜質(zhì)A、未知單雜和總雜虛高，與實際情況不符。

新修訂質(zhì)量標準方法采用乙腈-0.01%三氯乙酸系統(tǒng)的流動相，能將青蒿素峰、哌喹峰及其各雜質(zhì)峰有效分開，檢測結(jié)果準確度高。但三氯乙酸濃度不宜高，我們比較了0.01%、0.05%、0.1%3個濃度，發(fā)現(xiàn)酸濃度越高，對青蒿素和各雜質(zhì)峰的峰面積影響較大，峰降解越嚴重。

從破壞試驗看，各破壞條件下均降解產(chǎn)生未知雜質(zhì)，但雜質(zhì)A峰面積沒有變化，較穩(wěn)定。堿破壞條件和水溶液高溫破壞條件下，雜質(zhì)B峰面積增加明顯，穩(wěn)定性考察需重點關注。

耐用性試驗顯示，不同色譜柱對各峰的相對保留時間不一致，對雜質(zhì)B的含量計算差異也大。相同品牌色譜柱對各峰的相對保留時間一致，雜質(zhì)含量結(jié)果一致。建議使用該方法應注意流動相三氯乙酸的濃度配制要精準，以及要求使用固定品牌的色譜柱。

青蒿素原料中雜質(zhì)B的含量較低，部分原料中雜質(zhì)B幾乎不能檢出，參照《國際藥典》中青蒿素原料中有關物質(zhì)的方法，在系統(tǒng)適用性試驗中規(guī)定了青蒿素峰與雜質(zhì)A峰的分離度應大于4.0，并增加了相鄰色譜峰間分離度應大于1.5。

本研究對精密度試驗的樣品分別用外標法和自身對照法計算并進行比較，雜質(zhì)A用外標法計算含量為0.03%，sR為3.41%，用自身對照法計算含量為0.03%，sR為1.90%，合并兩組數(shù)據(jù)含量為0.03%，sR為4.71%，表明兩種方法計算結(jié)果一致。雜質(zhì)B用外標法計算含量為0.31%，sR為3.03%，用自身對照法計算含量為0.39%，sR為4.15%，合并兩組數(shù)據(jù)含量為0.35%，sR為12.70%，因雜質(zhì)B校正因子為0.90（在0.9～1.1范圍內(nèi)），但以自身對照法計算時雜質(zhì)B校正因子按1.00計算，又因用供試品溶液對照峰面積直接計算，故2種計算方法會有一定差異，但在允許范圍內(nèi)。參照《國際藥典》青蒿素有關物質(zhì)方法和2015年版《中國藥典》（二部）青蒿素哌喹片中青蒿素有關物質(zhì)方法，確定采用自身對照法計算，雜質(zhì)A需加校正因子。