郭社民

（河南省濮陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南 濮陽 457000）

青花合劑為結合中醫(yī)臨床應用研制的復方中藥制劑，主要由薏苡仁、大青葉、板藍根、金銀花、木賊、蛇床子、赤芍、紅花、醋香附等組成。具有清熱解毒、涼血消疣之功效。用于酒渣鼻、扁平疣、尖銳濕疣及其他傳染性軟疣等癥，臨床療效較好。為了有效控制該制劑的質量，參考相關文獻［1-6］對其質量標準進行了研究。

1 儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫）；UVIKONxl型紫外分光光度計（法國）；Sartorius CPA225D型電子分析天平（德國）；SK2200H型超聲清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，100 W，53 kHz）；ZF-2型三用紫外儀（上海安亭科學儀器廠）。大青葉對照藥材（批號：121367-200602）、金銀花對照藥材（批號：121060-201608）、蛇床子素對照品（批號：110822-201308） 均購于中國食品藥品檢定研究院；青花合劑（批號分別為20180823，20180927，20181019） 及陰性樣品均由濮陽市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；甲醇、乙腈為色譜純，其他均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 大青葉 取本品10 mL，加稀鹽酸調pH值至3～4，用三氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL，使溶解，作為供試品的溶液。取缺大青葉的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取大青葉對照藥材 0.5 g，加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2） 為展開劑，展開，取出，晾干，于日光下進行檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1。

2.1.2 金銀花 取本品10 mL，加稀鹽酸1 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，為供試品溶液。取缺金銀花的陰性樣品同法制成陰性對照溶液。另取金銀花對照藥材1.5 g，加入10 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以42% 的乙酸溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈下（365 nm）檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯出相同的藍色熒光斑點，陰性對照無干擾。見圖2。

圖1 大青葉TLC色譜

圖2 金銀花TLC色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為：乙腈-水 （67∶33）；流速為：1.0 mL·min-1；檢測波長：322 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按蛇床子素峰計算應不低于3000。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液：精密稱取蛇床子素對照品適量，加乙醇溶解并定量制成每1 mL含0.449 6 mg的溶液，作為儲備液。精密量取儲備溶2 mL置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。供試品溶液：精密量取供試品5 mL，置50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。陰性樣品溶液：取按處方比例制備不含蛇床子的陰性樣品，按“供試品溶液”制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 陰性干擾試驗 在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色圖譜，結果表明陰性樣品無干擾，見圖3。

圖3 HPLC色譜圖

2.2.4 線性關系考察 精密量取對照品儲備液0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2 mL，分別置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。按2.2.1項下色譜條件，分別進樣10 μL，記錄色圖譜，以對照品溶液濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，以蛇床子素峰面積（Y） 為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y=5.691 4×104X+8.705 5，r=0.999 9。結果表明，蛇床子素在0.036 0～0.143 9 mg·mL-1，濃度和峰面積線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液連續(xù)進樣5次，測定蛇床子素的色譜峰面積，計算峰面積的RSD為0.42%（n=5），表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積的RSD為0.63%（n=6），表明供試品溶液在10 h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批供試品（批號：20180823），按樣品含量測定項下方法，重復取樣測定5次，測得蛇床子素的平均含量為0.58 mg·mL-1，RSD為0.75% （n=5），結果表明測定方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的同一批樣品（批號：20180823，蛇床子素含量0.58 mg·mL-1）2.5 mL，共9份，分別置50 mL量瓶中，以3份為一組，分別精密加入蛇床子素對照品儲備液1.6，3.2，4.8 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定蛇床子素含量，計算回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 （n=9）

2.2.9 樣品含量測定 取樣品按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄蛇床子素色譜峰面積，按外標法計算含量，見表2。

表2 樣品含量測定結果 （mg·mL-1，n=3）

3 討論

（1）大青葉薄層鑒別試驗中曾以硅膠G薄層板，分別以甲苯-苯-醋酸乙酯-三氯甲烷 （2∶2∶1∶4）、甲苯-三氯甲烷-丙酮 （5∶4∶1）、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮 （5∶4∶2） 展開劑進行比較，均能將大青葉樣品完全分開，考慮到苯、甲苯的毒性，確定以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2） 為展開劑。另外，實驗結果表明，如展距超過8 cm，斑點易擴散，形狀變差；展開完成后不宜久置，應及時檢視，否則藍色斑點易消失。（2）蛇床子為青花合劑的主藥之一，經方法學考察，用高效液相色譜法能夠準確測定制劑中蛇床子素的含量，故選擇蛇床子素含量測定為本制劑的一項質量控制指標，根據含量測定結果及《中華人民共和國藥典》2015年版四部質量標準分析方法驗證指導原則的要求［7］，建議青花合劑中蛇床子素的含量限度為每1 mL不得少于0.5 mg。（3）對本制劑的相對密度、pH值進行了考察，結合生產工藝和成品檢查結果，建議相對密度限度為不低于1.03、pH值限度應為4.0～6.0，二者作為主要檢查項目；其他檢查項目應符合《中華人民共和國藥典》2015年版四部合劑項下有關的各項規(guī)定［7］。