錢霄晨,藺凱麗,黃 琦,溫小禮,姜天甲*,鄭小林
(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江省食品安全重點實驗室,浙江 杭州 310018)
香菇(Lentinus edodes)又稱黑蘑菇、橡木蘑菇、厚菇等,是一種世界著名的食用菌。其具有較高的營養(yǎng)價值,富含多種人體必需的氨基酸和微量元素,且有低脂肪、高蛋白的特點;在藥用價值上,其具有抗氧化、降血脂等功效。因香菇具有良好的營養(yǎng)價值和藥用價值,被賦予“菇中之王”等美譽[1-2]。采后的香菇極易發(fā)生霉變和褐變,其菌蓋與菌褶在常溫下放置1~2 d就會發(fā)生褐變[3],是一種高度易腐的農(nóng)產(chǎn)品。目前,香菇的保鮮方法有低溫貯藏、涂膜處理、氣調(diào)保鮮、輻射處理及化學(xué)保鮮等。這些方法在一定程度上能夠延長香菇的貯藏期,但具有一定的局限性,低溫處理易造成香菇凍害,輻射處理須嚴(yán)格控制劑量,化學(xué)試劑具有致癌、致畸變等副作用[4-5]。因此,開發(fā)更加可靠、安全、綠色的香菇保鮮劑尤為重要。
肉桂精油是一類從肉桂植物中以壓榨、蒸餾方式提煉出來的芳香精油,屬植物精油中的一種,因其具有抑菌、抗病毒和保持果蔬品質(zhì)等作用,可作為優(yōu)良的天然防腐劑,應(yīng)用于水果和蔬菜的保鮮。其中,有研究者發(fā)現(xiàn)將草莓[6]、鱷梨[7]、覆盆子[8]、藍莓[9]等用植物精油處理后能夠很好地提高其抗氧化能力,起到很好的保鮮效果。而Wu Yalan等[10]用肉桂醛熏蒸處理柑橘,發(fā)現(xiàn)肉桂醛熏蒸處理能夠顯著提高柑橘的超氧化物歧化酶活力和苯丙氨酸解氨酶活力,繼而降低果實酸敗腐病的發(fā)生率。Wang Yuan等[11]用肉桂醛處理獼猴桃,發(fā)現(xiàn)能夠提高獼猴桃的抗氧化能力并延緩其衰老。呂明珠等[12]等用肉桂醛處理紅提葡萄,發(fā)現(xiàn)肉桂醛熏蒸處理能夠較好地維持紅提葡萄的風(fēng)味品質(zhì),降低爛果率,有效地延長了貯藏期。有研究發(fā)現(xiàn),肉桂醛熏蒸處理能有效保持香菇采后的品質(zhì),通過抑制丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量上升,降低質(zhì)量損失率和脯氨酸的積累量,從而起到延緩衰老的作用,同時抑菌效果較顯著,能夠達到較好的保鮮效果[13-14];但有關(guān)肉桂醛熏蒸處理對香菇抗氧化性和多胺的影響目前鮮見報道。
多胺是一類具有生理活性的含氮化合物,分別以腐胺(putrescine,Put)、亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)3 種形式存在植物中。其主要通過加速細胞分化和影響酶活力來參與植物體的生長發(fā)育過程,在一定程度上有利于遺傳物質(zhì)、細胞膜的穩(wěn)定性,且在抗逆性、抗衰老等方面發(fā)揮著重要作用[15-16]。當(dāng)植株遭受水分脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫等環(huán)境脅迫時,植株內(nèi)游離態(tài)多胺的形態(tài)會發(fā)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化,游離態(tài)Put會轉(zhuǎn)化為游離態(tài)Spd、游離態(tài)Spm,且脅迫程度不同,游離態(tài)多胺形態(tài)的轉(zhuǎn)化程度不同。游離態(tài)多胺形態(tài)的轉(zhuǎn)變在一定程度上能夠減緩逆境脅迫所造成的傷害,維持正常的代謝活動。目前,游離態(tài)多胺在逆境脅迫中的生理功能、合成及代謝也愈加受到關(guān)注[17-18]。
本實驗以香菇為原材料,通過測定香菇在貯藏過程中的總酚含量、抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量、相關(guān)抗氧化物酶活力、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基清除能力及總抗氧化能力來研究肉桂精油熏蒸處理對香菇抗氧化能力的影響;測定Put、Spd、Spm含量來反映肉桂精油熏蒸處理對游離態(tài)多胺的影響;且通過觀察各指標(biāo)的變化趨勢,并與對照組進行比較,揭示肉桂精油熏蒸處理的作用效果,以期為進一步控制香菇采后褐變、延長貯藏期提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。
鮮香菇品種為‘香菇808’,采自浙江省杭州市老沙村茗香居農(nóng)莊。挑選個體大小均勻、菌蓋光滑、朵形完好、無機械損傷的香菇,采摘后當(dāng)日運回實驗室。
肉桂醛、Put、Spd、Spm 美國Sigma公司;總抗氧化能力測定試劑盒(比色法)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)碧云天生物技術(shù)研究所;乙腈、無水甲醇為色譜純。
I n fin i t e 2 0 0酶標(biāo)儀 瑞士Te c a n公司;KQ2200DB數(shù)控超聲波清洗儀 巴克超聲波科技有限公司;OrionStarSeries pH計 美國Thermo公司;ASW2-0501-U型實驗室超純水系統(tǒng) 法國Aquapro公司;POLYTRONPT-MR2100勻漿機 瑞士Kinematica公司;AB135-S電子天平 美國Mettlertoledo公司;UV-1800分光光度計 日本島津公司;DZF-6021型真空干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;100SERIES高效液相色譜儀美國Agilent公司;SORVALLStratos冷凍高速離心機德國Sigma公司;AF-10制冰機 美國Scotsman公司。
1.3.1 處理方法
剔除次品,挑選個體大小均勻、菌蓋光滑、朵形完好、無機械損傷、無開傘的香菇作為供試樣品。將挑選好的香菇隨機分成3 組,并從中選取20 個香菇放入由生產(chǎn)廠商定制的2 L大小的密封塑料保鮮盒中(貼有濾紙),每盒分別用0(CK)、8、40、80 nmol/L的肉桂醛溶液(溶劑為體積分數(shù)30%乙醇溶液)處理,且溶液須充分鋪于濾紙上,快速蓋上盒蓋,于密閉條件下充分熏蒸2 h。將處理后的香菇于4 ℃下貯藏30 d,貯藏期間每隔6 d取樣測定香菇的主要抗氧化活性和多胺指標(biāo)。每個處理做3 次平行實驗,整個實驗重復(fù)3 次。
1.3.2 指標(biāo)測定
1.3.2.1 總酚含量的測定
總酚含量參考李巨秀等[19]的方法測定。
1.3.2.2 AsA含量的測定
AsA含量的測定采用2,6-二氯酚靛酚法[20]。
1.3.2.3 APX活力的測定
參考Nakano等[21]的方法進行抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活力測定。取4.0 g香菇,加入到pH 7.5 50 mmol/L的磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、體積分數(shù)0.3%辛基苯基聚氧乙烯醚(polyethylene glycol tert-octylphenyl ether,Triton X-100)、2 mmol/L AsA和4 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP))中,并于冰浴中研磨,將得到的勻漿再用pH 7.5 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液定容到10 mL,然后在10 000 ×g、4 ℃下離心30 min得到上清液(酶液),并于290 nm波長處測量吸光度。
1.3.2.4 CAT活力的測定
參考Wang Yousheng等[22]的方法進行氧化氫酶(catalase,CAT)活力測定。取4.0 g樣品,并立刻放入冰預(yù)冷過的pH 7.0、0.1 mol/L的10 mL磷酸鉀緩沖液(含1 mmol/L的EDTA、2 g/100 mL PVP)中,用勻漿機打成漿液,再在4 ℃下,13 000×g離心30 min得上清液,于240 nm波長處測量吸光度,酶活力單位為U/g。
1.3.2.5 SOD、GR活力和ABTS陽離子自由基清除能力、總抗氧化能力的測定
SOD、GR活力分別按照SOD、GR測定試劑盒使用說明書進行測定。ABTS陽離子自由基清除能力、總抗氧化能力的測定分別參考總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)、總抗氧化能力測定試劑盒(比色法)使用說明書進行測定。
1.3.2.6 游離態(tài)多胺含量的測定
參考魏云瀟[23]的方法進行游離態(tài)多胺(Put、Spd、Spm)含量的測定。
各指標(biāo)均以香菇鮮質(zhì)量進行計算。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和Duncan’s差異顯著性檢驗,P<0.05表示差異顯著,采用Origin 8.5軟件作圖。
圖1 肉桂醛熏蒸處理對香菇總酚(A)和AsA(B)含量的影響Fig. 1 Effects of cinnamaldehyde fumigation on total phenolic (A) and AsA (B) content in shiitake mushroom during storage
酚類物質(zhì)和AsA是香菇的活性成分,與香菇的抗氧化性具有一定的相關(guān)性。一般而言,酚類物質(zhì)含量越高,抗氧化性越強[24]。而AsA作為果蔬中的自由基清除劑,能有效清除單線態(tài)氧、超氧化物、羥自由基,從而保持一些化合物的生物活性,抑制酶促反應(yīng)[25]。由圖1A可知,各處理組總酚含量變化趨勢基本一致,0~24 d總體呈下降趨勢,24 d后再呈上升趨勢。在整個貯藏期間,各肉桂醛熏蒸處理組的總酚含量均高于對照組,其中,40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組于0~12 d的總酚含量明顯高于對照組,較為有效地抑制了總酚含量的下降。但總體而言,各組無明顯差異。因此肉桂醛熏蒸處理對香菇總酚含量無明顯影響。
由圖1B可知,在整個貯藏過程中,對照組的AsA含量始終低于80 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組。貯藏前12 d,對照組AsA含量低于80 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組,但高于8 nmol/L和40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組。之后,對照組的AsA含量低于各濃度的肉桂醛熏蒸處理組。8 nmol/L肉桂醛熏蒸處理的AsA含量呈現(xiàn)0~18 d內(nèi)先下降、18~24 d上升、24 d后再下降趨勢。40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理的AsA含量變化趨勢與8 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組相似,只是40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的AsA含量于第12天處于最低點,并于第24天達到最高值,為8.320 3 mg/100 g,與此時對照組差異顯著(P<0.05)。對照組和80 nmol/L肉桂醛熏蒸組的AsA含量呈現(xiàn)前6 d內(nèi)先上升、6~18 d下降、18 d后再上升的趨勢。在24 d后,80 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的AsA含量仍持續(xù)升高。由此可得出,前期處理過程中,高濃度的肉桂醛處理有助于提高AsA含量,而低濃度的肉桂醛處理會對AsA含量的升高具有抑制效果。而后期(24 d后),各濃度的肉桂醛熏蒸處理均能較好地減少AsA含量的降低。
圖2 肉桂醛熏蒸處理對香菇APX(A)、CAT(B)、SOD(C)、GR(D)活力的影響Fig. 2 Effects of cinnamaldehyde fumigation on APX (A), CAT (B),SOD (C) and GR (D) activity in shiitake mushroom during storage
APX、CAT、SOD、GR均是植物代謝中的抗氧化酶,其中APX在植物活性氧代謝中起著重要的作用,能夠延緩果蔬的衰老褐變[26];CAT是一種廣泛存在于植物中的末端氧化酶,其能在活性氧代謝過程中起到清除過氧化氫的作用,從而提高植物的抗逆性[27];SOD是植物體內(nèi)活性氧自由基清除系統(tǒng)的第一道防線,其能催化氧自由基轉(zhuǎn)化為O2和H2O2,從而降低具有毒性的氧自由基對細胞造成的傷害[28];GR是一種低分子質(zhì)量巰基化合物,是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶,能夠使植物體內(nèi)的谷胱甘肽從氧化態(tài)變成還原態(tài),并在植物逆境響應(yīng)代謝途徑中起到保護細胞的作用[29]。由圖2可知,在整個貯藏期間,各肉桂醛熏蒸處理組的APX、CAT、SOD、GR活力均高于對照組。由圖2A可知,在整個貯藏過程中,各組APX活力先降低后升高。在第24天,各肉桂醛熏蒸處理組與對照組存在顯著性差異(P<0.05),可得出采用肉桂醛熏蒸處理有助于提高香菇APX活力。
由圖2B可知,香菇中的CAT活力在0~6 d先下降、6~18 d上升、18 d后再下降的趨勢。CAT活力在第18天達到最大值,其中40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組CAT活力為753.0 U/g,而對照組為421.13 U/g,各處理組顯著大于對照組(P<0.05)。表明經(jīng)過肉桂醛熏蒸處理可明顯地提高香菇的CAT活力,進而起到清除活性氧的作用,提高抗逆性。
由圖2C可知,在貯藏過程中,香菇的SOD活力總體上在0~6 d先上升,6 d后再下降。其中,8 nmol/L的肉桂醛熏蒸處理組的SOD活力于第6天達到最大值(729.0 U/g)。在0~12 d,各處理組的SOD活力和對照組無顯著差異。隨后,各肉桂醛熏蒸處理組的SOD活力均逐漸高于對照組,40 nmol/L的肉桂醛熏蒸處理組的SOD活力最高,且于第30天,與對照組有顯著差異(P<0.05)。因此,香菇通過一定濃度的肉桂醛處理可提高抗氧化酶SOD活力,從而有利于細胞膜的穩(wěn)定性。
由圖2D可知,香菇的GR活力于0~24 d上升,24 d后下降。其中,40 nmol/L肉桂醛處理組于第24天的GR活力為28.14 U/g,顯著高于對照組(P<0.05)。表明肉桂醛熏蒸處理能夠有效提高香菇的GR活力。
圖3 肉桂醛熏蒸處理對香菇ABTS陽離子自由基清除能力(A)和總抗氧化能力(B)的影響Fig. 3 Effects of cinnamaldehyde fumigation on ABTS cation radical scavenging capacity (A) and total antioxidant activity (B) in shiitake mushroom during storage
香菇的ABTS陽離子自由基清除能力與總抗氧化能力的強弱緊密相關(guān),可反映總抗氧化能力[30]。由圖3可知,在整個貯藏期間,各肉桂醛熏蒸處理組的ABTS陽離子自由基清除能力和總抗氧化能力均高于對照組。由圖3A可知,在0~6 d,各組香菇的ABTS陽離子自由基清除能力均有較大幅度的提升;其中,40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的ABTS陽離子自由基清除能力上升較明顯,于第6天達到241.23 μg/g,比對照組高39.39%。貯藏后期(24~30 d),各組的ABTS陽離子自由基清除能力均呈略微下降的趨勢,且各處理組的下降幅度低于對照組。結(jié)果表明肉桂醛熏蒸處理能夠提高香菇的抗氧化能力,從而延緩香菇的衰老褐變。
如圖3B所示,不同濃度的肉桂醛熏蒸處理對香菇的總抗氧化能力均有不同程度的影響。在整個貯藏期間,各處理組的總抗氧化能力均高于對照組,40 nmol/L處理組和80 nmol/L處理組總抗氧化能力變化趨勢基本一致,均為上升趨勢。而8 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組和對照組呈下降趨勢。其中,40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組于第30天的抗氧化能力為23.74 U/g,為對照組的1.79 倍,差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明不同濃度的肉桂醛處理對香菇總抗氧化能力的變化趨勢有較大影響,且均能顯著提高香菇的總抗氧化能力。
圖4 肉桂醛熏蒸處理對香菇游離態(tài)多胺含量的影響Fig. 4 Effects of cinnamaldehyde fumigation on free polyamines content in shiitake mushroom during storage
由圖4A可得,在整個貯藏過程中,游離態(tài)Put含量總體呈先上升后下降的趨勢。40、80 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的游離態(tài)Put始終高于對照組,在貯藏第10天與對照組的差距最大,此時40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的游離態(tài)Put含量達到了0.259 7 mg/g,與對照組顯著差異(P<0.05)。在香菇的貯藏后期(20 d后),各組游離態(tài)Put含量均呈下降趨勢,且各處理組的游離態(tài)Put含量均高于對照組。
由圖4B可得,香菇中游離態(tài)Spd含量趨勢是先上升后下降,最后趨向于穩(wěn)定。各處理組的游離態(tài)Spd含量總體上均低于對照組,只是在貯藏15 d時,40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理組的游離態(tài)Spd含量要略高于對照組。在第5天時,對照組的Spd含量達到最大值(1.750 mg/g),高于各處理組。在后期(15~25 d)各組游離態(tài)Spd含量相近。
由圖4C可得,香菇在貯藏期間,各組游離態(tài)Spm含量總體上是先上升后下降,各處理組的游離態(tài)Spm含量于第5天達到峰值,而對照組于第10天達到峰值。在第5 天,8、40、80 nmol/L的肉桂醛熏蒸處理組游離態(tài)Spm含量分別比對照組顯著高357.1%、235.0%、347.1%(P<0.05)。在貯藏10 d后,各組的游離態(tài)Spm含量相對穩(wěn)定,且對照組游離態(tài)Spm含量高于各肉桂醛處理組。
綜上,在香菇的貯藏期間,整體上對照組的游離態(tài)Put含量相對低于各肉桂醛處理組,而游離態(tài)Spd和Spm含量要高于各肉桂醛處理組,這可能與香菇的防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān),使游離態(tài)Put轉(zhuǎn)化成游離態(tài)Spd和Spm,游離態(tài)Spd和Spm含量增多,從而得以應(yīng)對活性氧的毒害作用和衰老過程中的一些生理傷害。而肉桂醛熏蒸處理能夠減少游離態(tài)多胺形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化,說明肉桂醛處理可緩解采后香菇在成熟衰老過程中所造成的傷害,延長香菇的貯藏期。
褐變、衰老是存在于采后果蔬中的普遍現(xiàn)象,其與活性氧代謝緊密相關(guān)。果蔬在采后貯藏過程中,活性氧清除系統(tǒng)的功能會相對減弱且活性氧代謝極易失衡,導(dǎo)致活性氧的積累,從而破壞細胞膜,對細胞產(chǎn)生傷害[31]。而植物體自身具有自由基清除系統(tǒng),通過清除自由基抵御自由基產(chǎn)生的傷害[32]。自由基清除系統(tǒng)包含了抗氧化體系中各抗氧化代謝循環(huán)、抗氧化物質(zhì)、大部分抗氧化酶,在植物體的成熟衰老過程中發(fā)揮著重要的作用[33-34]。植物精油是一種具有揮發(fā)性的次級代謝產(chǎn)物,適宜濃度的植物精油能在一定程度上提高采后果蔬的抗氧化物含量及抗氧化酶活力,控制褐變,延緩植物的成熟與衰老[35]。有研究表明,植物精油在藍莓、油桃、草莓采后保鮮應(yīng)用中較為廣泛,其能在一定程度上清除自由基并維持酚類物質(zhì)及抗氧化物質(zhì)的含量,繼而提高果實的抗氧化能力[36-39]。肉桂醛作為植物精油中的有效成分,在采后果蔬保鮮方面取得了良好的效果。本研究采用不同濃度的肉桂醛處理香菇,發(fā)現(xiàn)處理組的AsA含量于貯藏后期下降的趨勢得以抑制,同時能夠保持相關(guān)抗氧化酶APX、CAT、SOD、GR活力。處理組ABTS陽離子自由基清除能力和總抗氧化能力均優(yōu)于對照組。Jin Peng等[40]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理能夠提高楊梅相關(guān)的抗氧化酶活力和抗氧化能力;李述剛等[41]發(fā)現(xiàn)一定濃度的環(huán)氧乙烷高級脂肪醇與肉桂精油復(fù)合處理冬棗,能夠很好地保持過氧化氫酶活力,達到較好的保鮮效果,二者的結(jié)論與本研究相一致。由此可見,肉桂醛熏蒸處理能夠維持較高的抗氧化酶活力及抗氧化物含量,提高果蔬的抗氧化性,繼而有利于細胞膜的穩(wěn)定性,延緩衰老褐變,延長貯藏期。
多胺是一類植物體內(nèi)具有生物活性的低分子質(zhì)量的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),其作為信號分子,可通過加速細胞分化和影響酶活力來參與植物體的生長發(fā)育過程,在遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的合成方面發(fā)揮著巨大作用。此外,其可提高植物對外界環(huán)境的抗逆性,從而延緩衰老[42]。有研究表明,當(dāng)果蔬受到逆境脅迫時,為維持正常的生理、代謝活動,游離態(tài)Put會轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)Spd、Spm,得到較高含量的游離態(tài)Spd及Spm,進而抵御外界及自身成熟衰老過程中產(chǎn)生的一系列傷害[43]。在本實驗中,各肉桂醛處理組游離態(tài)Put含量相對高于對照組,而游離態(tài)Spd、Spm含量要低于對照組,表明肉桂醛熏蒸處理能夠一定程度上減少果蔬衰老過程中所造成的一些生理傷害。
不同濃度的肉桂醛熏蒸處理均能夠提高香菇的相關(guān)抗氧化物酶(APX、CAT、SOD、GR)活力、ABTS陽離子自由基清除能力、總抗氧化能力,且抑制貯藏后期AsA含量的下降,使其保持較高的抗氧化能力,從而抵抗自由基產(chǎn)生的傷害,保護細胞,延緩衰老變質(zhì);然而,肉桂醛熏蒸處理對總酚含量的影響甚微。此外,肉桂醛熏蒸處理能夠通過減少游離態(tài)Put向游離態(tài)Spd、Spm的轉(zhuǎn)化,起到保護細胞膜、穩(wěn)定細胞內(nèi)部成分的作用,提高香菇的抗逆性。其中,40 nmol/L肉桂醛熏蒸處理香菇的效果最佳。綜上,適宜濃度的肉桂醛熏蒸處理能夠顯著提高和保持香菇的抗氧化能力和抗逆性,本實驗結(jié)果在香菇的貯藏保鮮中具有良好的研究意義和應(yīng)用價值。